免疫組化SP法檢測人乳腺癌組織中VEGF和VEGF-C的表達(dá)及意義

（營口市中心醫(yī)院，遼寧 營口 115000）

乳腺疾病主要分布于患者乳腺腺體、脂肪、淋巴、乳頭等部位，主要分為乳腺炎癥、乳腺病變、乳腺腫瘤等。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生擴(kuò)散后，使乳腺其他器官發(fā)生病變，嚴(yán)重危害患者的生命安全[1]。乳腺腫瘤在生長過程中會攝取患者體內(nèi)的營養(yǎng)成分和氧氣，通過血管內(nèi)皮生長因子為載體進(jìn)行擴(kuò)散[2]。本研究旨在研究免疫組化SP法檢測人乳腺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）的表達(dá)情況及檢測意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月至2019年5月營口市中心醫(yī)院收治的150例人乳腺癌患者作為乳腺癌組，對其進(jìn)行病理檢查和免疫組化SP法檢測。所有患者均為女性；年齡34～58歲，平均年齡（43.25±6.21）歲；絕經(jīng)患者63例，未絕經(jīng)患者87例；根據(jù)乳腺癌組織病理學(xué)分類（2003）標(biāo)準(zhǔn)，上述患者的癌癥分型為浸潤型導(dǎo)管癌，其中98例患者出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。另選取同期50例良性病變的乳腺纖維腺瘤患者作為良性乳腺纖維腺瘤組，對其進(jìn)行免疫組化SP法檢測，所有患者均為女性；年齡35～60歲，平均年齡（45.78±4.36）歲；絕經(jīng)患者19例，未絕經(jīng)患者31例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：不配合研究、精神異常者；患者心、肝、腎等器官嚴(yán)重異常者；在診斷前進(jìn)行其他輔助治療者。

1.2 方法

1.2.1 試劑 選取上海然泰生物科技代理的美國zymed公司生產(chǎn)的VEGF測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）以及鼠抗人VEGF單克隆抗體和兔抗人VEGF-C多克隆抗體。設(shè)備為酶標(biāo)儀和血液分析儀，酶標(biāo)儀的型號為Stat Fax-210，血液分析儀的生產(chǎn)廠家和型號為Sysmex公司SF-3000自動血液分析儀。

1.2.2 方法 對乳腺癌患者和良性乳腺纖維腺瘤患者進(jìn)行病理檢查和免疫組化SP法檢測。①取樣：測量腫物病變大小、標(biāo)記切緣、周圍病變情況，若腫物有包膜，需觀察并描述腫物與包膜的關(guān)系，并描述腫物性狀，若腫物較小需采用多切面切開，若腫物距切緣較遠(yuǎn)，應(yīng)取具有代表性的切緣進(jìn)行取樣，采用乳腺腫物切除法進(jìn)行細(xì)胞活檢，并制作標(biāo)本將其保存?zhèn)溆?。在VEGF檢測過程中，血清應(yīng)在術(shù)前采用真空保存，并加入促凝劑進(jìn)行固定，同時(shí)采集患者晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血3.5 mL，將其在室溫下放置10～15 min后，選取轉(zhuǎn)數(shù)為2 500 r/min的離心機(jī)進(jìn)行離心處理，10 min后分離血清。將制備好的血清放入Eppendorf管中，在-20 ℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?。②檢驗(yàn)：對所有樣本進(jìn)行蘇木素-伊紅染色法（HE染色法）以及免疫組化染色。在進(jìn)行免疫組化染色過程中，采用過氧化酶SP檢測法，其中過氧化酶采用鏈霉素抗生物素蛋白作為藥劑，在無菌環(huán)境下嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，同時(shí)將石蠟進(jìn)行切片并將其進(jìn)行脫蠟操作，將霉素抗生物素蛋白3%過氧化氫進(jìn)行水浴加熱，有效清除該藥劑中內(nèi)源性過氧化物的酶活性，再利用抗原微波進(jìn)行熱修復(fù)，并用8%山羊血清對非特異的位點(diǎn)進(jìn)行封閉，在操作完成后，將血清去除，在樣本中分別依次滴加鼠抗人VEGF單克隆抗體和兔抗人VEGF-C多克隆抗體，在37 ℃下進(jìn)行孵育，持續(xù)時(shí)間為12 h，并滴加酶生物素，采用HE染色對樣本進(jìn)行染色，最后封片。

1.3 觀察指標(biāo) 對免疫組化SP法檢測人乳腺癌組織的結(jié)果進(jìn)行判定。VEGF陽性界值為107.6 pg/mL（X+1.96 s）。其中，將不著色細(xì)胞定義為陰性，用-表示，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%記為弱陽性，用+表示，陽性細(xì)胞介于25%～50%記為陽性，用++表示，陽性細(xì)胞＞50%記為強(qiáng)陽性，用+++表示。其中，VEGF與VEGF-C陽性表達(dá)為：患者腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜出現(xiàn)清晰的黃棕色顆粒，選取其在40倍以下的低倍顯微鏡中觀察陽性細(xì)胞最密集的區(qū)域，然后將該區(qū)域的細(xì)胞用100倍顯微鏡進(jìn)行放大。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者VEGF與VEGF-C的表達(dá)情況比較 乳腺癌組中VEGF陽性率為67.33%（101/150），其中強(qiáng)陽性為20.00%（30/150）；陽性為41.33%（62/150），弱陽性為6.00%（9/150）；VEGF-C陽性率為59.33%（89/150），其中強(qiáng)陽性為17.33%（26/150）；陽性為30.67%（46/150），弱陽性為11.33%（17/150）。良性乳腺纖維腺瘤組中VEGF陽性率為16.00%（8/50），其中強(qiáng)陽性為2.00%（1/50）；陽性為8.00%（4/50），弱陽性為6.00%（3/50）；VEGF-C陽性率為4.00%（2/50），其中強(qiáng)陽性為0；陽性為2.00%（/50），弱陽性為2.00%（1/50）。乳腺癌組中VEGF陽性率高于良性乳腺纖維腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.952，P=0.012）

2.2 兩組患者VEGF與VEGF-C的表達(dá)特征比較 乳腺癌組和良性乳腺纖維腺瘤組中VEGF與VEGF-C強(qiáng)陽性表達(dá)呈棕褐色，位于癌細(xì)胞組織內(nèi)，陽性表達(dá)呈黃褐色，位于細(xì)胞膜內(nèi)，弱陽性表達(dá)呈黃色，位于細(xì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。兩組患者VEGF與VEGF-C的表達(dá)特征沒有差異。

3 討論

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生在乳腺腺上皮組織。乳腺癌細(xì)胞在生長過程中喪失了正常細(xì)胞的特性，容易脫落，游離的乳腺癌細(xì)胞會隨著血液、淋巴液擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移到全身，嚴(yán)重危及患者的生命安全。乳腺癌細(xì)胞主要通過人VEGF為載體進(jìn)行擴(kuò)散，VEGF是一種陽離子糖蛋白，能夠有效促進(jìn)血管表皮細(xì)胞進(jìn)行增生、遷移，同時(shí)還會增加毛細(xì)血管的通透性，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激，為其提供良好的生長、存活以及增生環(huán)境和條件[3-5]。通過VEGF能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供生長必要的營養(yǎng)成分，為腫瘤細(xì)胞提供轉(zhuǎn)移環(huán)境。VEGF包括VEGF-A、B、C、D、E以及胎盤生長因子[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者的血清VEGF、VEGF-C及陽性表達(dá)情況較良性腫瘤患者顯著增高（P＜0.05），其原因主要是患者的腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF通過血管壁進(jìn)入血液循環(huán)中使其濃度增高。另外，乳腺癌患者與良性腫瘤患者的VEGF與VEGF-C強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性表達(dá)出的性狀無差異，以及VEGF與VEGF-C的生長位置無差異均位于癌細(xì)胞組織、細(xì)胞膜以及細(xì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[8]。乳腺癌患者血清VEGF與VEGF-C與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期具有密切聯(lián)系，癌細(xì)胞陽性表達(dá)率與分期成正比。因此，采用免疫組化SP法檢測人乳腺癌組織中VEGF和VEGF-C的表達(dá)在臨床上具有重要意義[9-10]。

總之，乳腺癌患者的VEGF、VEGF-C的表達(dá)情況與乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移具有直接關(guān)系，免疫組化SP法檢測能夠有效提高乳腺癌患者的VEGF、VEGF-C的陽性檢出率。