非洲豬瘟疫苗和病原學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

楊佳萍，寇美玲，，謝佳芮，苗海生

（1.施甸縣畜牧獸醫(yī)中心，云南施甸 678200；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬和野豬引起的一種急性、熱性和高度致死性傳染病。該病發(fā)病快、病程短，病死率可高達(dá)100%，為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報(bào)動(dòng)物疫病，也是我國重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病。2018 年8 月首次發(fā)現(xiàn)ASF 疫情后，我國采取了撲殺疫區(qū)內(nèi)生豬等一系列緊急防控措施，截至2021年5 月底，全國報(bào)告發(fā)生ASF 疫情共191 起，累計(jì)撲殺生豬121.01 萬頭，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[1-3]。由于ASFV 具有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，使得疫苗開發(fā)極具挑戰(zhàn)性，至今仍無安全有效疫苗上市[4]。在豬群沒有進(jìn)行有效疫苗接種的前提下，ASFV 抗體產(chǎn)生存在一定的滯后性，抗體檢測易出現(xiàn)假陽性且無法判定現(xiàn)癥感染[5]。因此，建立快速、可靠的病原學(xué)診斷方法對(duì)于該病早期的防控和撲滅具有重要意義。本文綜述了當(dāng)前國內(nèi)外ASF 疫苗和病原學(xué)診斷技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為今后ASF 疫苗研制和診斷技術(shù)選擇提供參考。

1 疫苗研究

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗是通過物理或化學(xué)過程使病原微生物喪失感染性與毒性，但仍保留免疫原性的一類疫苗。ASF 剛被發(fā)現(xiàn)時(shí)，研究人員就以滅活疫苗為主要研制方向，但迄今為止，所研制的各種滅活疫苗均不能抵御ASF 強(qiáng)毒株的攻擊，不能提供有效保護(hù)[6]。Blome 等[7]利用新型佐劑PolygenTM或Emulsigen?-D 研制出的滅活疫苗，雖然能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)性的特異抗體，但所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均無法抵御ASFV 攻擊，不能提供有效的免疫保護(hù)作用。因此，該類疫苗當(dāng)前已不作為研究的重點(diǎn)方向。

1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過分離鑒定天然致弱毒株或使用人工手段產(chǎn)生致弱毒株，經(jīng)特殊培養(yǎng)后所制備的活疫苗。與滅活疫苗相比，減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈持久的免疫應(yīng)答，同源保護(hù)率高，但毒力有自然返強(qiáng)的可能，存在諸多生物安全隱患。根據(jù)毒株來源不同，可將ASFV 弱毒活疫苗的研制分為傳統(tǒng)減毒活疫苗和重組減毒活疫苗兩類。

1.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗 20 世紀(jì)60 年代，西班牙和葡萄牙暴發(fā)ASF 疫情后，有研究者進(jìn)行了田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)弱毒活疫苗能為豬只提供同源保護(hù)及部分異源保護(hù)，但接種豬出現(xiàn)了肺炎、流產(chǎn)等多重感染，且增加了ASFV 再次感染的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。后有學(xué)者利用天然分離的致弱毒株（OURT88/3 或NH/P68）制備減毒活疫苗。這類疫苗能對(duì)同源ASFV產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，但對(duì)異源ASFV 保護(hù)率低甚至沒有保護(hù)，且存在毒力自然返強(qiáng)、臨床副作用嚴(yán)重等問題[10-11]。近年來，隨著新分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是基因編輯技術(shù)的突破性進(jìn)展，這種基于自然毒株弱化的方式已逐漸被淘汰。

1.2.2 重組減毒活疫苗 科研人員利用基因編輯、同源重組等分子生物學(xué)技術(shù)將ASFV 毒力基因敲除，以降低ASFV 毒力，致力于研制安全有效的重組致弱活毒株疫苗。Borca 等[12]發(fā)現(xiàn)：從Georgia07 分離株（ASFV-G）中刪除一個(gè)先前未經(jīng)鑒定的基因I177L會(huì)導(dǎo)致其毒力完全衰減。肌肉注射缺失I177L基因ASFV-G-ΔI177L毒株的動(dòng)物，在28 d 的觀察期內(nèi)臨床癥狀正常，且病毒血癥滴度低，沒有病毒脫落，并出現(xiàn)強(qiáng)烈的特異性抗體反應(yīng)；重要的是，當(dāng)與強(qiáng)毒力親本菌株ASFV-G 競爭時(shí)，即使在低劑量免疫的情況下，它們也能提供保護(hù)，在安全候選疫苗中極具潛力，為ASFV 減毒活疫苗的研制提供了新的技術(shù)和研究思路。Chen等[13]以我國第一株ASFV 分離株HLJ/2018 為骨架，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了一系列不同基因缺失的重組病毒，通過在豬體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)的致病力、免疫原性和免疫保護(hù)性試驗(yàn)，遴選出一株7 個(gè)基因缺失的病毒（HLJ/18-7GD）；通過對(duì)其安全性、有效性進(jìn)行試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該毒株可對(duì)強(qiáng)毒的致死性攻擊提供有效免疫保護(hù)，不產(chǎn)生病毒血癥，且不存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)；該毒株對(duì)育肥豬生長發(fā)育和接種母豬繁殖性能無不良影響，對(duì)田間商品豬存活保護(hù)率在80%以上，是當(dāng)前所研發(fā)的疫苗中保護(hù)性和安全性兼具的疫苗，具有良好的應(yīng)用前景。但鑒于能繁母豬生產(chǎn)利用周期長，該疫苗接種后的安全性、有效性等有待進(jìn)一步觀測、評(píng)估。

1.3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是基于選擇合適的ASFV 抗原基因進(jìn)行開發(fā)的，與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗相比，基因工程疫苗成本低且安全性高，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV 特異性抗體及相應(yīng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但面對(duì)強(qiáng)毒株攻擊的有效保護(hù)作用不強(qiáng)。目前基因工程疫苗研究主要集中在p72、p30、p54、CD2v等抗原基因及其編碼蛋白，包括亞單位疫苗、DNA 疫苗、病毒活載體疫苗。

1.3.1 亞單位疫苗 亞單位疫苗是利用特異性ASFV 基因和蛋白的表達(dá)來產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一類疫苗。其研究策略主要是將具有中和表位的ASFV 保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，然后將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽遞呈給抗原遞呈細(xì)胞，以誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗ASFV 中和抗體。與其他疫苗相比，亞單位疫苗較安全，但保護(hù)性不強(qiáng)，目前已研發(fā)的亞單位疫苗還無法抵御強(qiáng)毒株的攻擊[14-15]。研究表明，針對(duì)p72和p54基因所表達(dá)的蛋白對(duì)病毒吸附具有抑制作用，而針對(duì)p30所表達(dá)的蛋白則對(duì)病毒內(nèi)化具有抑制效果，說明這些功能性蛋白在針對(duì)感染所產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，但經(jīng)p30或p54基因疫苗免疫的豬在面對(duì)急性ASF時(shí)均沒有保護(hù)作用[16]。Netherton 等[17]利用腺病毒和痘苗病毒作為載體，表達(dá)18 種能被ASFV 特異性淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未能提供有效保護(hù)，但接種豬血液中的病毒滴度明顯低于未免疫豬。Jancovich 等[18]通過干擾素-γ 酶聯(lián)免疫吸附點(diǎn)試驗(yàn)測定了豬免疫淋巴細(xì)胞對(duì)單個(gè)重組蛋白和ASFV的反應(yīng)。利用DNA 抗原病毒將47 種ASFV 蛋白的重組痘苗病毒疫苗免疫豬后篩選ASFV 的保護(hù)性抗原，結(jié)果篩選出p30 和p72 蛋白能有效刺激機(jī)體體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答；雖然免疫豬出現(xiàn)了與急性ASF 一致的臨床和病理體征，但與未免疫豬相比，其血液和一些淋巴組織中的病毒基因組水平顯著降低。因此，研究和開發(fā)更多的ASFV 保護(hù)性抗原或新型免疫佐劑，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答效力是當(dāng)前研制ASFV 亞單位疫苗的關(guān)鍵。

1.3.2 DNA 疫苗 DNA 疫苗是通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達(dá)載體后，直接導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白，從而激活宿主特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。DNA 疫苗制備簡單、成本低廉，可同時(shí)表達(dá)多種抗原且無毒力逆轉(zhuǎn)危險(xiǎn)，但其中和病毒能力不強(qiáng)，面對(duì)ASFV 強(qiáng)毒株的攻擊不能提供有效保護(hù)[19]。Argilaguet 等[20]將CD8+T 細(xì)胞作為ASFV 保護(hù)的關(guān)鍵元件，設(shè)計(jì)了一個(gè)新的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)pCMV-UbsHAPQ，編碼3 種病毒決定因子（sHA、p54 和p30）與泛素融合，旨在改善Ⅰ類抗原，并增強(qiáng)誘導(dǎo)CTL 的效應(yīng)。結(jié)果顯示，在不存在抗體的情況下，該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)能成功誘導(dǎo)免疫豬特異性的T 細(xì)胞反應(yīng)，且可保護(hù)一部分免疫豬免受ASFV 的致命挑戰(zhàn)。Sunwoo 等[21]用ASFV 質(zhì)粒DNA（CD2v，p72，p32，+/?p17）和重組蛋白（p15，p35，p54，+/?p17）混合后對(duì)豬進(jìn)行3 次接種，以測試聯(lián)合DNA-蛋白疫苗是否能抵抗ASFV Armenia 2007 株的攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫豬雖然產(chǎn)生了特異性抗體，但缺乏中和病毒的能力，而且被觀察到在體外ASFV 感染力增強(qiáng)。因此，DNA 疫苗要達(dá)到有效免疫保護(hù)的目標(biāo)仍需要進(jìn)一步深入研究。

1.3.3 病毒活載體疫苗 病毒活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)，將致病微生物免疫保護(hù)性抗原的基因，導(dǎo)入到載體病毒或細(xì)菌的非必須區(qū)而構(gòu)建重組病毒，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗。該類疫苗在對(duì)抗人類易感病毒或動(dòng)物易感病毒中均得到了廣泛應(yīng)用，并取得了良好的應(yīng)用效果。Lokhandwala等[22-23]評(píng)估了多種腺病毒載體新型ASFV 抗原的免疫原性，將重組腺病毒配制在佐劑中混合免疫商品豬，發(fā)現(xiàn)免疫豬大多數(shù)能夠誘導(dǎo)安全強(qiáng)特異性抗體和IFN-γ 細(xì)胞分泌。但是，這些研究還未涉及免疫保護(hù)試驗(yàn)和安全性評(píng)估，其保護(hù)效力和安全性仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Murgia 等[24]利用α 病毒載體平臺(tái)傳遞表達(dá)ASFV 抗原的復(fù)制粒子（RPs）抗原，分別構(gòu)建了表達(dá)ASFVp30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）的抗原載體，并且測試了3 種載體抗原在Vero 細(xì)胞中的表達(dá)和在豬身上的免疫原性。結(jié)果顯示，RP-30 在Vero 細(xì)胞中表達(dá)最高，在豬中免疫原性最高，其次是RP-54和RP-sHA-p72。該研究通過用ASFV 天然減毒株OURT88/3 增強(qiáng)免疫RP-30 接種豬，證實(shí)了將減毒活病毒增強(qiáng)策略和載體表達(dá)抗原構(gòu)建相結(jié)合可擴(kuò)大對(duì)ASFV 表位的識(shí)別。Lokhandwala 等[25]再次使用BioMize 和ZTS-01 兩種佐劑對(duì)豬進(jìn)行鼻內(nèi)刺激免疫，通過該方法來評(píng)估兩種不同“雞尾酒”佐劑的保護(hù)效果。結(jié)果顯示：BioMize 佐劑可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，但80%疫苗接種豬死于強(qiáng)毒株Georgia2007 的攻擊；相比之下，ZTS-01 佐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體反應(yīng)較弱，但約56%豬能夠抵抗強(qiáng)毒株Georgia2007 的攻擊，在攻毒后17 d 內(nèi)表現(xiàn)的臨床癥狀輕微，且無病毒血癥。ASFV 活載體疫苗的研究還在持續(xù)進(jìn)行中，載體毒株的選擇，保護(hù)性抗原的選擇和設(shè)定以及佐劑的優(yōu)化是該類疫苗的重點(diǎn)研究方向。

2 病原學(xué)診斷技術(shù)

目前沒有商品化的疫苗可用于ASF疫情防控，因此建立快速、可靠的病原診斷方法，對(duì)于該病早期預(yù)警和科學(xué)防控具有重要意義。病原學(xué)診斷技術(shù)是針對(duì)病原體本身采取的檢測方法，能夠在ASF暴發(fā)早期檢測出動(dòng)物體內(nèi)是否帶毒。相較于血清學(xué)檢測，病原學(xué)檢測能更快速、可靠地確定病原體。檢測人員也可根據(jù)臨床發(fā)病情況和實(shí)驗(yàn)室診斷條件選擇合適的檢測方法。例如，快速鑒別診斷、核酸定量可采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和微滴數(shù)字PCR（ddPCR）類核酸檢測技術(shù)，基層現(xiàn)場快速檢測可使用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）類等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)，或成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白技術(shù)（CRISPR/Cas）等。具體適用場景可根據(jù)自身的人員情況、儀器設(shè)備和試驗(yàn)條件選擇合適的檢測方法。

2.1 qPCR

qPCR 方法是將光譜技術(shù)引入到PCR 反應(yīng)中，通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化定量測定特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的一種核酸定量檢測技術(shù)。該技術(shù)與常規(guī)PCR 相比，去掉了瓊脂糖凝膠電泳，速度更快，具有特異靈敏、定量準(zhǔn)確、操作簡便以及樣品污染小和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[26]。OIE 及國家ASF 參考實(shí)驗(yàn)室均公布了標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，為ASF 診斷提供了技術(shù)支撐。此外，崔貝貝等[27]以ASFVK196R基因?yàn)榘袠?biāo)，建立了快速檢測 ASFV 的TaqMan qPCR 檢測方法，證實(shí)該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，對(duì)檢測樣品和環(huán)境要求相對(duì)較低，且與其他多種豬病病原不存在交叉反應(yīng)，適合大批量樣品檢測。吳亞楠等[28]參照GenBank 登錄的ASFVP72相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)合成1 對(duì)特異性引物與1個(gè)TaqMan 探針，通過反應(yīng)條件和反應(yīng)體系優(yōu)化，建立了快速檢測ASFV 的TaqMan qPCR 方法。驗(yàn)證結(jié)果顯示，該試驗(yàn)所建立的方法具有很好的靈敏性、特異性和重復(fù)性。目前qPCR 方法是篩查和確診ASFV 感染的主要方法，許多縣市級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心和屠宰場均配備了相應(yīng)的儀器設(shè)備，具備了檢測ASFV的能力。但是，qPCR 產(chǎn)物易污染環(huán)境和試劑，需要嚴(yán)格劃分樣品處理、試劑配制和擴(kuò)增區(qū)域，一旦操作不當(dāng)就會(huì)出現(xiàn)假陽性，必要時(shí)還需進(jìn)行普通PCR 驗(yàn)證和序列測定。

2.2 ddPCR

ddPCR 結(jié)合了液滴微流控芯片與數(shù)字PCR 技術(shù)，是一種新的絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)不僅繼承了數(shù)字PCR 技術(shù)高通量、高靈敏度、低消耗等優(yōu)點(diǎn)，而且解決了傳統(tǒng)數(shù)字PCR 芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜、加工困難、成本高等問題。它不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，在低濃度的核酸含量下也可高度靈敏和準(zhǔn)確地對(duì)核酸拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量，在核酸分子的絕對(duì)定量領(lǐng)域具有極大潛力[29-30]。原霖等[31]建立的ddPCR 方法，最低檢測限可達(dá)0.8 copies/μL，檢測結(jié)果與qPCR 相符，且敏感性高于qPCR，因此更加適用于ASFV的早期檢測以及泔水、飼料、豬肉產(chǎn)品中微量核酸的檢測，對(duì)于防控和開展流行病學(xué)溯源工作都具有重要意義。嚴(yán)禮等[32]根據(jù)ASFV 核酸的2 段保守序列（VP72和K205基因），合成3 對(duì)引物和探針，在摸索條件、優(yōu)化方法后，比較方法的線性、特異性、靈敏性和重復(fù)性。結(jié)果表明，這3 種方法重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，能滿足快速定量檢測的要求，且不與常見的2 種豬病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，適用于豬肉及其制品中的ASFV 檢測，有利于在源頭、食品加工、食品銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)，加強(qiáng)對(duì)生鮮豬肉及各類豬肉制品的檢測，切實(shí)降低潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于該檢測方法所需要儀器設(shè)備價(jià)格高昂，目前主要在高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室使用，尚未能在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

2.3 LAMP

LAMP 是日本Notomi[33]發(fā)明的一種基于鏈置換DNA 聚合酶的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法不需要PCR 中的熱變性、溫度循環(huán)、電泳成像等過程，只需簡單的恒溫設(shè)備即可完成基因擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測，且整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間一般少于60 min。田純見等[34]利用高度保守的非結(jié)構(gòu)DNA 聚合酶G1211R基因，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立了實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，檢測ASFV 核酸靈敏度達(dá)到10-5以上，相當(dāng)于每個(gè)反應(yīng)體系可以檢出21 pg 病毒DNA，優(yōu)于qPCR 檢測結(jié)果（10-3），且重復(fù)性和特異性良好，與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及昆蟲核酸等無交叉反應(yīng)，有利于不同基因型毒株檢測和出入境快速篩查。王林等[35]根據(jù) ASFVP72基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化引物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，建立了一種基于SYTO9 熒光染料的實(shí)時(shí)熒光LAMP 快速檢測方法。該方法可在40 min內(nèi)完成檢測反應(yīng)。LAMP 技術(shù)與常規(guī)PCR 方法相比具有敏感性高，操作簡單、快速，對(duì)儀器設(shè)備要求低，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場、可視化檢測等優(yōu)點(diǎn)，但常因操作不當(dāng)造成產(chǎn)物污染試劑，再次檢測時(shí)易出現(xiàn)假陽性，并且單份樣品檢測成本較高，因而目前尚未大面積推廣。

2.4 RPA

RPA 是一種由重組酶、單鏈DNA 結(jié)合蛋白和鏈置換Bsu 聚合酶參與的恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)在體外進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)不需要加熱，在23～45 ℃下即可完成對(duì)雙鏈DNA 的解鏈處理并進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，不需要昂貴的控溫設(shè)備，反應(yīng)時(shí)間只需5～20 min，特異性強(qiáng)、靈敏度高，與qPCR 相比更簡單、經(jīng)濟(jì)、快速，適用于實(shí)驗(yàn)室外及資源匱乏地區(qū)的現(xiàn)場檢測[36]。張皓淳等[37]選擇pcDNA12L 和pcDNA13L作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，建立了RPA 等溫檢測方法，檢測結(jié)果體現(xiàn)出RPA 具有較好的特異性和敏感性，與PCR 檢測方法相比檢測下限提高程度明顯，具有一定運(yùn)用優(yōu)勢。吳映彤等[38]基于MGF360-12L基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物，建立了RPA 等溫檢測方法。結(jié)果顯示：該方法35 ℃恒溫反應(yīng)30 min 即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的穩(wěn)定擴(kuò)增；檢測限可達(dá)到103個(gè)拷貝，同普通PCR 方法檢測限一致，但反應(yīng)時(shí)間僅為普通PCR 的1/4；與其他豬病毒無交叉反應(yīng)，特異性較強(qiáng)；操作簡單、反應(yīng)快速、檢測成本低，可滿足疫病快速現(xiàn)場檢測的需求。目前該檢測方法在推廣中面臨的瓶頸問題主要是需要進(jìn)行專門的核酸提取，導(dǎo)致反應(yīng)快速的突出優(yōu)勢并未完全展示，另外還存在檢測成本較高和穩(wěn)定性差的問題。

2.5 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas 核酸檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的檢測技術(shù)，一經(jīng)問世便得到了廣泛關(guān)注。該技術(shù)由CRISPR RNA（cr RNA）和Cas 蛋白組成，是原核生物的“免疫系統(tǒng)”，其中crRNA 與靶序列互補(bǔ)，可引導(dǎo)Cas 蛋白進(jìn)行序列特異性識(shí)別和切割，對(duì)入侵的核酸分子進(jìn)行切割使其降解，從而釋放出信號(hào)達(dá)到檢測效果。CRISPR/Cas 核酸檢測技術(shù)可提供快速、靈敏、現(xiàn)場、特異的定量分析與多重分析，不需要繁瑣的操作處理及昂貴的輔助儀器，僅通過熒光、電化學(xué)及可視化等方法進(jìn)行信號(hào)讀取，就可實(shí)現(xiàn)病原微生物的精準(zhǔn)檢測、監(jiān)測與控制，是目前ASFV 檢測的熱門方向[39]。Wang 等[40]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a 技術(shù)和橫向流檢測（CRISPR/Cas12a-LFD）的快速、敏感、無儀器的ASFV 檢測方法。該方法所檢測樣本結(jié)果與qPCR檢測一致，但檢測時(shí)間比qPCR 更短，且與其他豬DNA 病毒無交叉反應(yīng)，比較適用于現(xiàn)場診斷。He等[41]將CRISPR-Cas 檢測技術(shù)與基于熒光的護(hù)理點(diǎn)（POC）系統(tǒng)結(jié)合起來，建立了一個(gè)高通量、全液相的等溫檢測系統(tǒng)。該方法易操作、特異性強(qiáng)、敏感度高，且不需要專家指導(dǎo)。目前該技術(shù)仍然處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，未見有商品化的產(chǎn)品推出。

3 展望

面對(duì)ASF 疫情，我國雖然采取了封鎖隔離、撲殺疫點(diǎn)內(nèi)生豬等一系列緊急防控措施，但疫情仍時(shí)有發(fā)生，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。要阻斷疫病的傳播，除了做好生物安全防控措施外，疫苗和準(zhǔn)確的早期診斷是亟需的防控手段。近年來，ASF 疫苗的研究雖取得了較大進(jìn)展，但由于ASFV具有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，使得當(dāng)前所研發(fā)的疫苗株接種豬后普遍存在免疫保護(hù)效果不佳、毒力返強(qiáng)、副反應(yīng)嚴(yán)重等問題?；谝陨蠈?duì)疫苗研究現(xiàn)狀的分析，在眾多的疫苗研發(fā)策略中，目前只有利用天然分離或敲除ASFV 毒力基因的致弱毒株開發(fā)重組減毒活疫苗具有較好的利用前景，尤其是ASFV-G-ΔI177L與HLJ/-18-7GD 候選疫苗株，被認(rèn)為是短期內(nèi)保護(hù)效果最理想的疫苗株，但安全性和有效性仍有待進(jìn)一步研究。隨著對(duì)ASFV 基因組結(jié)構(gòu)、免疫逃逸機(jī)制的深入研究和CRISPR/Cas9 等新型分子生物學(xué)技術(shù)的興起，相信安全、高效、特異性強(qiáng)的ASF 疫苗面世將指日可待。

目前在沒有有效疫苗免疫的前提下，建立快速、可靠的早期病原診斷方法對(duì)于ASF 疫情確認(rèn)和控制同樣至關(guān)重要。近年來，ASFV 檢測技術(shù)發(fā)展迅速，ddPCR、LAMP、RPA、CRISPR/Cas 等新興診斷技術(shù)相繼建立，與傳統(tǒng)檢測方法相比，這些新的檢測技術(shù)操作更簡單，檢測速度更快，特異性更強(qiáng)，但其檢測能力與適用場景尚存在一定不足，還需要進(jìn)一步完善。隨著生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，未來ASFV 檢測的研究方向應(yīng)建立在成本低廉、簡單便捷、高效準(zhǔn)確、集成化的基礎(chǔ)上，或可將多種診斷方法聯(lián)合應(yīng)用，各取所長。