獅源貓細(xì)小病毒分離鑒定及其VP2 基因序列分析

呂夢(mèng)娜，韋柳明，單 芬，彭仕明，陳 武，翟俊瓊

（1.廣州動(dòng)物園，廣州市野生動(dòng)物研究中心，廣東廣州 510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

貓細(xì)小病毒（feline parvovirus，F(xiàn)PV）又名貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（feline panleukopenia virus），是造成動(dòng)物患上貓泛白細(xì)胞減少癥（feline panleukopenia，F(xiàn)PL）的病原[1]。FPL 是一種高度傳染性和致死性疾病，其臨床特征是急性腸炎，出現(xiàn)嚴(yán)重脫水和敗血癥，以淋巴衰竭和全血細(xì)胞減少為顯著特征[2-3]。FPV 已經(jīng)被歐美地區(qū)多個(gè)國(guó)家定義為嚴(yán)重的貓傳染病之一。1957 年Bilin 首次分離培養(yǎng)出該病毒，1964 年Johnson 從豹的脾臟中也分離出FPV[4]。

FPV 是無(wú)囊膜的單股DNA 病毒，其病毒粒子直徑為20～24 nm，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。

FPV 的衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3 組成，其中VP2 占90%，為最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，決定宿主范圍和病毒與宿主的相互作用[5]。FPV 基因組全長(zhǎng)4～6 kb，相對(duì)分子質(zhì)量為（1.5～2.0）×106。FPV 在自然界中分布極為廣泛，對(duì)外界因素抵抗力強(qiáng)[6]，60 ℃加熱30 min 不能使其完全滅活；對(duì)乙醚、氯仿和丙酮等脂溶性溶劑和酸、堿、酚（0.5%）及胰蛋白酶都有抵抗力，0.2%～0.5%甲醛溶液處理20～24 h 能夠使其滅活，0.5%福爾馬林和0.175%次氯酸鈉能有效將其殺滅[7-8]。

研究表明，F(xiàn)PV 在自然條件下可感染虎、豹、獅等大型貓科動(dòng)物[3，9-12]，而小型貓科動(dòng)物和水貂最易感[13]。國(guó)外研究者還曾對(duì)俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的野生東北虎進(jìn)行FPV 抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性率很高[14]。在我國(guó)，F(xiàn)PV 全年流行，尤其是冬季及初春季節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)獅源FPV 的研究較少。為此，本研究通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)從非洲獅糞便中分離得到1 株FPV，并對(duì)其VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，以了解FPV 的遺傳進(jìn)化情況，對(duì)該病的診斷和治療提供依據(jù)，也為后期相關(guān)疫苗的研制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病料及主要試劑

本研究所用的貓腎細(xì)胞F81，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物教研室饋贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和凍存；病料，由廣東省某動(dòng)物園提供，且經(jīng)膠體金試紙條檢測(cè)為細(xì)小病毒陽(yáng)性；病毒總RNA/DNA 提取試劑盒，購(gòu)自AXYGEN；膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA；pMDTM19-T 載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ExTaq酶、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自TAKARA；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液和0.25%胰蛋白酶，購(gòu)自Gibco。

1.2 引物設(shè)計(jì)

登錄NCBI 查找細(xì)小病毒序列，用Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)并合成2 對(duì)特異性引物。其中：1對(duì)為鑒定細(xì)小病毒引物，目的條帶大小約為600 bp（F1：5'-AAAGAGTAGTTGTAAATAATT-3'；R1：5'-CCTATATAACCAAAGTTAGTAG-3'）；1 對(duì)為擴(kuò)增細(xì)小病毒VP2基因引物，目的條帶大小約為1 800 bp（F2：5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3'；R2：5'-GGAATATAATTTTCTAGGTGCTAGT-3'）。2 對(duì)引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 病料收集與處理

采集廣東省某動(dòng)物園疑似感染FPV 的非洲獅糞便，用適量已滅菌的PBS 稀釋成懸液并加入青、鏈霉素，渦旋振蕩后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾除菌后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離培養(yǎng)與鑒定

常規(guī)方法培養(yǎng)F81 細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄培養(yǎng)基，用PBS 小心清洗后，加入0.25%的EDTA 胰蛋白酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞逐漸脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基終止消化并吹打均勻。細(xì)胞傳代的同時(shí)，在培養(yǎng)液中按體積比1/10 的量接種處理好的病毒濾液，同時(shí)設(shè)立不接毒的對(duì)照組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，若還未產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）則將培養(yǎng)液更換為含2%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察3～4 d，每天觀察有無(wú)產(chǎn)生CPE；若無(wú)CPE，盲傳4～5 代，仍無(wú)棄之。若出現(xiàn)CPE ≥80%，則反復(fù)凍融3 次收毒，提取細(xì)胞培養(yǎng)物DNA，使用鑒定引物按照25.0 μL反應(yīng)體系（Primemix ExTaq酶12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min），產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝電泳觀察結(jié)果。若條帶大小相符，送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 VP2 基因擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析

以1.4 中提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增VP2基因序列（反應(yīng)體系、程序以及操作同1.4）；電泳后切膠回收目的條帶大小的產(chǎn)物，將其連接到pMDTM19-T 載體，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含Amp+的LB 平板；待平板上形成肉眼可見(jiàn)的單個(gè)菌落后，挑取單個(gè)菌落搖菌提取質(zhì)粒，將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI 上的26 個(gè)序列（表1）進(jìn)行比較，用軟件MEGA 6.06 分析本研究得到的VP2基因與參考毒株的遺傳進(jìn)化規(guī)律，用MegAlign 分析核苷酸序列同源性。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定

病毒濾液接種F81 細(xì)胞，盲傳至第3 代，48 h后細(xì)胞發(fā)生典型病變，表現(xiàn)為細(xì)胞拉絲現(xiàn)象，隨后，細(xì)胞間隙慢慢變大，逐漸脫落（圖1）。經(jīng)細(xì)小病毒特異性引物PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在600 bp左右處出現(xiàn)特異性條帶且對(duì)照組為陰性，與預(yù)期目的條帶片段大小一致（圖2），測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)確定為FPV，并將該毒株命名為FPV CHNHN-1。

圖1 細(xì)胞接毒培養(yǎng)結(jié)果

圖2 病毒培養(yǎng)液PCR 鑒定結(jié)果

2.2 VP2 基因序列擴(kuò)增與測(cè)序

經(jīng)細(xì)小病毒VP2特異性引物擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在1 800 bp 左右處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致（圖3），經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒、測(cè)序、拼接得到FPV CHNHN-1 毒株的VP2基因序列。

圖3 VP2 基因擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PV CHN-HN-1 毒株VP2蛋白的6 個(gè)決定宿主差異的氨基酸位點(diǎn)80、93、103、323、564 和568 位均未發(fā)生改變（圖4），而當(dāng)80、564 和568 位分別為賴氨酸、天冬酞胺和丙氨酸時(shí)，細(xì)小病毒只能在貓科動(dòng)物體內(nèi)增殖。

圖4 VP2 基因測(cè)序峰圖

2.3 VP2 基因序列分析

將FPV CHN-HN-1 的VP2基因序列與GeneBank 上公布的26 株參考株VP2基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。由圖5 可知，分離株FPV CHNHN-1 與GeneBank 上公布的其他26 株毒株同源性在97.8%～100%，其中與JN-FPV-96（MZ836373.1）、TZ-FPV-112（MZ836368.1）、FPV-SH2003（MW811187.1）、BJ051（MT270580.1）相似性最高，均為100%；而與98-10SA2010（HQ602986.1）、118/2010（KF373598.1）相似性最低，均為97.8%。

圖5 VP2 基因核苷酸同源性分析結(jié)果

2.4 VP2 基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

使用MEGA6.06 軟件將FPV CHN-HN-1 毒株與國(guó)內(nèi)外26 株細(xì)小病毒VP2基因核酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖6）顯示，F(xiàn)PV CHN-HN-1 株與其他7 株FPV 同屬一個(gè)大的分支，與JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遺傳距離最近，與其他犬源和狐源的細(xì)小病毒參考毒株遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖6 基于VP2 基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論

FPV 是一種單鏈DNA 病毒，在家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物中均有流行，動(dòng)物感染后出現(xiàn)高熱、急性腸炎、嘔吐、白細(xì)胞減少和心肌炎等癥狀，對(duì)犬、貓、鼬等家養(yǎng)、圈養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及野生貓科動(dòng)物的危害十分嚴(yán)重。江蘇、安徽、湖北等10 余個(gè)省市都曾發(fā)生過(guò)FPV 感染事件[15-16]。近年來(lái)，由于家養(yǎng)犬、貓等動(dòng)物疫苗的使用，細(xì)小病毒病得到很好地控制，但在野生動(dòng)物中還時(shí)有發(fā)生[17-18]。曾有學(xué)者用血凝抑制試驗(yàn)（HI）對(duì)我國(guó)某野生動(dòng)物園圈養(yǎng)虎進(jìn)行FPV 血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性率接近50%[8]；2017 年李同義等[19]報(bào)道某動(dòng)物園東北虎和非洲獅感染細(xì)小病毒?？梢?jiàn)，大型貓科動(dòng)物如虎、獅感染該病毒也十分普遍。到目前為止，國(guó)內(nèi)雖然有關(guān)于虎細(xì)小病毒序列的分析報(bào)道，但暫未有獅源細(xì)小病毒序列的相關(guān)分析報(bào)道，因此應(yīng)加強(qiáng)大型貓科動(dòng)物FPV 監(jiān)測(cè)，以減少該病的發(fā)生與流行。

VP2 蛋白是FPV 主要的抗原蛋白，其非常保守，與病毒的血凝特性、致病性密切相關(guān)。本研究成功從疑似感染FPV 的非洲獅糞便中分離出FPV CHN-HN-1 毒株。對(duì)該分離株的VP2基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增測(cè)序，并分析其遺傳變異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株與26 株參考株的序列相似性為97.8%～100%，與JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPVSH2003、BJ051 高度同源，相似性均為100%，同時(shí)決定分離株VP2 蛋白的6 個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)均未發(fā)生突變，這符合FPV 的序列特征。遺傳進(jìn)化分析顯示，F(xiàn)PV CHN-HN-1 與其他7 株貓?jiān)醇?xì)小病毒同屬一個(gè)分支，表明本株獅源FPV 與貓?jiān)碏PV病毒親緣關(guān)系較近，與犬源和狐源的細(xì)小病毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳進(jìn)化分析進(jìn)一步證明分離株FPV CHN-HN-1 起源于FPV。

動(dòng)物園作為大型圈養(yǎng)貓科動(dòng)物的主要活動(dòng)場(chǎng)所，除了在動(dòng)物早期進(jìn)行免疫預(yù)防接種，加強(qiáng)環(huán)境消毒外，還應(yīng)做好FPV 分子流行病學(xué)和遺傳變異機(jī)制研究，以便對(duì)該病的診斷和治療提供依據(jù)，也為后期相關(guān)疫苗的研制打下基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)也具有重要意義。