布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

王 剛，范偉興，劉 坤，田麗華，溫建新

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.青島西海岸新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東青島 266400）

布魯氏菌?。╞rucellosis，以下簡(jiǎn)稱布?。┦亲畛Ｒ姷娜双F共患病之一，其病原為布魯氏菌（Brucella）。布魯氏菌是一種短小的球桿狀菌，革蘭氏染色陰性，主要包括牛種、羊種、豬種、犬種、綿羊附睪種和沙林鼠種，共有19 個(gè)生物型[1]。20世紀(jì)90 年代，在海洋哺乳動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)了2 種布魯氏菌，即鰭腳種和鯨種[2-3]。我國(guó)將布病列為乙類傳染病、二類動(dòng)物疫病。布病給畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康帶來了很大危害，而有效的檢測(cè)方法能夠?yàn)椴疾〉念A(yù)防、檢測(cè)和凈化提供技術(shù)支持。本文重點(diǎn)就布病血清學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為布病檢測(cè)、診斷和凈化提供參考。

1 常規(guī)檢測(cè)方法

目前已經(jīng)形成了多樣化、綜合性的布病檢驗(yàn)方法，主要包括病原學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)（PCR）以及血清學(xué)檢測(cè)。

1.1 病原學(xué)檢測(cè)

通過從病料組織、奶樣和其他樣品中分離出布魯氏菌，從而明確感染。病原學(xué)檢測(cè)能夠?yàn)椴疾√峁┳钪庇^的證據(jù)，但分離出布魯氏菌后，需要純化培養(yǎng)進(jìn)行生化鑒定，此過程步驟較多，耗時(shí)長(zhǎng)。而且布魯氏菌的分離、培養(yǎng)和鑒定需要在專門的P3 實(shí)驗(yàn)室（生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境、生物安全要求和試驗(yàn)器材要求較高，難以在基層推廣。

1.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

利用試劑盒提取樣本或直接提取滅活的布魯氏菌核酸，然后利用PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。分子生物學(xué)檢測(cè)也能夠?yàn)椴疾〉拇_定提供強(qiáng)有力的證據(jù)，敏感性很高，可以同時(shí)檢測(cè)大量樣本，檢測(cè)效率高。但是分子生物學(xué)檢測(cè)需要提取核酸然后進(jìn)行PCR操作，試劑盒以及引物價(jià)格較為昂貴，一般需要耗費(fèi)幾個(gè)小時(shí)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有一定的要求，需要在專門的實(shí)驗(yàn)室操作，對(duì)專業(yè)儀器要求較高，也不適合在基層推廣應(yīng)用[4]。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)

布病檢測(cè)中使用最多的方法是血清學(xué)檢測(cè)，與前兩種方法相比，大多數(shù)血清學(xué)檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便、省時(shí)和廉價(jià)。血清學(xué)檢測(cè)適合在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，有些甚至能夠在田間進(jìn)行，在短時(shí)間內(nèi)能夠得到試驗(yàn)結(jié)果，適合大量樣品的檢測(cè)，對(duì)于基層的布病檢測(cè)確診具有重要意義。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）

RBT是檢測(cè)布魯氏菌抗體最常用的方法之一，也是重要的布病檢測(cè)方法，能夠快速診斷動(dòng)物布病。虎紅抗原能夠與血清樣本中的布魯氏菌抗體結(jié)合，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。將血清樣本和虎紅抗原充分混勻一段時(shí)間后，觀察凝集現(xiàn)象并做出判別，從而完成布病檢測(cè)。RBT 具有很多優(yōu)點(diǎn)：操作步驟少，操作簡(jiǎn)便；短時(shí)間內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間；檢測(cè)試劑價(jià)格不高，節(jié)約檢測(cè)成本；檢測(cè)敏感性較高，具有較高的檢出率[5]。RBT 需要用到的試驗(yàn)工具比較簡(jiǎn)易，僅需要虎紅抗原即可完成檢測(cè)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，也有利于基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。因此，RBT 經(jīng)常被用于大量樣品的布病初篩。但RBT 的檢測(cè)結(jié)果容易受到非特異性抗體的影響，表現(xiàn)為假陽(yáng)性[6]。為使試驗(yàn)結(jié)果偏差較小，采集的血清應(yīng)該是清亮、無溶血的，且應(yīng)避免反復(fù)凍融，這樣就能夠消除血清中的纖維蛋白原，從而提高準(zhǔn)確性[7-8]。

2.2 試管凝集試驗(yàn)（SAT）

SAT是一種檢測(cè)血清中布魯氏菌抗體的方法。布魯氏菌抗原能夠與血清中的IgM 抗體反應(yīng)產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，通過肉眼觀察試管中的凝集現(xiàn)象可做出結(jié)果判定[9]。SAT 特異性較強(qiáng)，不易受其他干擾因子影響，陽(yáng)性結(jié)果比較準(zhǔn)確[10]。但SAT 也存在一定的不足，如每個(gè)血清樣本需要4 支試管來實(shí)現(xiàn)4個(gè)梯度的試驗(yàn)，在進(jìn)行大批量樣本檢測(cè)時(shí)，需要大量的試管，試驗(yàn)過程中還需要24 h 的孵育時(shí)間，不僅對(duì)耗材的需求量較大，且試驗(yàn)時(shí)間也較長(zhǎng)。而針對(duì)不同動(dòng)物血清（如羊、豬、狗、牛、馬、鹿、駱駝等），試驗(yàn)的具體步驟也有所差別。SAT 操作步驟繁瑣，且在結(jié)果判定時(shí)，受人為主觀因素影響較大，因此需要與其他檢測(cè)方法對(duì)比，綜合判定檢測(cè)結(jié)果[11]。

2.3 全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）

與其他的血清學(xué)檢測(cè)方法不同，MRT 主要通過檢測(cè)牛奶樣本中的抗體來實(shí)現(xiàn)布病檢測(cè)，且一般僅用于奶牛的布病檢測(cè)，不適用于其他品種家畜。如果待檢牛奶樣本中存在布魯氏菌抗體，就會(huì)與試驗(yàn)用的紅色布魯氏菌抗原形成復(fù)合物，這些復(fù)合物會(huì)形成紫紅色的乳脂環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)布病檢測(cè)[12]。相比較于其他需要血清的檢測(cè)方法，MRT 具有一定的優(yōu)勢(shì)，無論是單一奶牛的牛奶還是混合的大缸奶，都能實(shí)現(xiàn)布病檢測(cè)，無需采血，不會(huì)使奶牛因驅(qū)趕、保定、采血等行為產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使奶牛產(chǎn)量不受影響，養(yǎng)殖戶更容易接受。MRT 的敏感性能夠滿足大型牛場(chǎng)布病的現(xiàn)場(chǎng)篩查，特異性較強(qiáng)，操作快捷而簡(jiǎn)便，試劑成本不高，試驗(yàn)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，是一種能夠代替SAT 的布病檢測(cè)方法[13]。但是，如果牛奶樣本存放時(shí)間較長(zhǎng)，或試驗(yàn)溫度較高導(dǎo)致牛奶樣本腐敗，檢測(cè)結(jié)果就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。當(dāng)牛奶樣本中存在的初乳較多或者混合樣本量較大時(shí)，也有可能出現(xiàn)一定的假陽(yáng)性結(jié)果。因此MRT 對(duì)牛奶樣本有一定的要求，需要新鮮、無初乳以及無乳房腺的牛奶。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

用于布病檢測(cè)的ELISA 有兩種：間接ELISA（iELISA）和 競(jìng) 爭(zhēng)ELISA（cELISA）。iELISA是待檢血清樣本中的布魯氏菌抗體與ELISA 板上固定的布魯氏菌抗原物質(zhì)結(jié)合，利用酶標(biāo)抗體檢測(cè)，然后通過底物顯色，最后用酶標(biāo)儀來讀值。iELISA 靈敏度較高，標(biāo)記的抗體較少，成本更低，但是試驗(yàn)周期更長(zhǎng)。cELISA 步驟較復(fù)雜，但可以檢測(cè)含有布魯氏菌抗體的不純凈血清，數(shù)據(jù)再現(xiàn)性更高，但是整體敏感性和特異性稍低。ELISA 檢測(cè)布病的敏感性較高，用酶標(biāo)儀判定試驗(yàn)結(jié)果，避免了肉眼觀察判定結(jié)果的誤差，但對(duì)專業(yè)儀器要求較高，檢測(cè)試劑比較昂貴，增加了檢測(cè)成本，此外檢測(cè)過程中對(duì)環(huán)境溫度的要求也較高，因而限制了ELISA 的使用。

2.5 熒光偏振測(cè)定法（FPA）

FPA 是近年來使用越來越廣泛的布病檢測(cè)方法之一。該方法利用了溶液中分子越大旋轉(zhuǎn)速度越慢的原理[14]。將FPA 抗原用熒光分子標(biāo)記，如果待檢血清中有目標(biāo)抗體，那么抗原和抗體就會(huì)結(jié)合成更大的分子，結(jié)合后的分子旋轉(zhuǎn)速度變慢，用一定角度的偏振光測(cè)量旋轉(zhuǎn)時(shí)間，此時(shí)偏振值如果升高，就說明樣品血清呈陽(yáng)性。FPA 需要專業(yè)的熒光偏振儀器，抗原和血清中抗體反應(yīng)迅速，能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量的血清樣品，操作比較簡(jiǎn)單，容易學(xué)會(huì)，特異性和敏感性與ELISA 相似，但比ELISA 更加節(jié)省時(shí)間。雖然我國(guó)的FPA 技術(shù)起步較晚，但是目前已經(jīng)研發(fā)出較為成熟的配套試劑盒，這對(duì)我國(guó)布病防控具有十分重要的意義[15]。

2.6 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）

待檢血清樣本中如果有布魯氏菌抗體，就會(huì)與抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，形成的復(fù)合物會(huì)與補(bǔ)體結(jié)合，從而降低了補(bǔ)體反應(yīng)液的濃度，結(jié)果顯示為陽(yáng)性[16]。CFT 的特異性和敏感性都高于SAT，但是CFT 的操作較為繁瑣，試驗(yàn)步驟較為復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，試驗(yàn)要求較高，因此不易普及，應(yīng)用不廣泛[17-18]。

2.7 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（NH-GD）

NH-GD 是利用光滑型布魯氏菌表面的一種天然半抗原來鑒定布病疫苗免疫和野毒感染的方法[19]。布病的檢測(cè)，不容易區(qū)分疫苗因素和野毒感染產(chǎn)生的陽(yáng)性結(jié)果。而NH-GD 能夠解決這一問題，且具有很好的特異性和重復(fù)性，但抗原的提取和純化以及試驗(yàn)方法仍需優(yōu)化。NH-GD 操作技術(shù)簡(jiǎn)便，所需要的試驗(yàn)儀器簡(jiǎn)單，特別適合在基層推廣使用。

3 展望

目前這幾種常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，為布病的檢測(cè)提供了多樣化的方式。不同的血清學(xué)檢測(cè)方法具有各自的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用過程中也存在一定的不足。通過對(duì)比以上幾種血清學(xué)檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)RBT、MRT、ELISA、FAP 和NH-GD 更適合用于布病初篩，而SAT 和CFT 更加適用于復(fù)核。

目前布病的血清學(xué)檢測(cè)方法中還沒有一種完全具備敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快和檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)方法，因此在布病檢測(cè)的實(shí)際臨床應(yīng)用中，常需兩種或兩種以上的方法相互配合使用，通過對(duì)不同檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行比較分析，來綜合判斷樣品的檢測(cè)結(jié)果。除了現(xiàn)有的檢測(cè)方法外，應(yīng)該探索更多的新的布病檢測(cè)方法，例如熒光微球法、半抗原鑒別診斷方法等，以豐富布病的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)化當(dāng)前檢測(cè)方法的不足，讓布病的血清學(xué)檢測(cè)更加準(zhǔn)確、便捷和高效。