斯鈣素2基因在家畜上的研究進(jìn)展

張莉英， 李隴平， 陳 宏， 藍(lán)賢勇

(1．榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；2．陜西省白水縣城關(guān)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，陜西 白水 715600；3．榆林學(xué)院 陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林 719000；4．西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

斯鈣素(stanniocalcin，STC)為一類分泌型糖蛋白激素，最早在硬骨魚的斯尼氏小體中發(fā)現(xiàn)，近年來在人和哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)存在STC，它參與體內(nèi)Ca2+、PO43-平衡調(diào)節(jié)，且與機(jī)體的生理、代謝、生殖、生長發(fā)育，甚至應(yīng)激反應(yīng)都有關(guān)聯(lián)。STC2是STC家族成員之一。本文主要從STC2的發(fā)現(xiàn)、分子結(jié)構(gòu)及其在家畜生理、病理方面的作用等做一綜述。

1 STC2的發(fā)現(xiàn)及分子結(jié)構(gòu)

1998年從人類骨肉瘤cDNA文庫分離出編碼STC2基因的cDNA。該基因位于染色體5q35上，大小約13 kb，包含4個(gè)外顯子[1]。其基因表達(dá)產(chǎn)物為STC2，也稱斯鈣素2相關(guān)肽，是一個(gè)小分子，由302個(gè)氨基酸組成的親水性蛋白，存在11個(gè)α螺旋和1個(gè)β折疊，這是STC2穩(wěn)定發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其N末端具有1段信號(hào)肽，長約24個(gè)氨基酸殘基，還有由1段15個(gè)氨基酸殘基組成的前導(dǎo)序列，這表明STC2是一種分泌型糖蛋白質(zhì)。在合成的過程中經(jīng)信號(hào)肽固定至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的粗糙面，剪切掉信號(hào)肽開始翻譯，加工成熟后經(jīng)膜泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。

2 STC2的功能

STC2在哺乳動(dòng)物多種組織細(xì)胞和器官中均有表達(dá)，參與與磷酸鹽調(diào)節(jié)有關(guān)的生理、代謝、再生、應(yīng)激反應(yīng)等過程。已發(fā)現(xiàn)STC2與多種疾病有關(guān)，其表達(dá)水平在多種惡性腫瘤細(xì)胞上改變明顯，可作為多種腫瘤疾病診斷的標(biāo)記基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。在正常組織中，骨骼中表達(dá)量最高，提示在骨骼生長發(fā)育過程中有某些作用。Ishibashi認(rèn)為STC2在腎臟上抑制磷酸鹽攝取，因?yàn)樗麄儼l(fā)現(xiàn)，STC2轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞后，其培養(yǎng)介質(zhì)在小鼠腎臟中能抑制Na+/PO43-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)啟動(dòng)子的活性。Moore等人利用Northern Blot和雙重染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在胰島素α細(xì)胞中也檢測到STC2的表達(dá)并染色，說明STC2可能與血糖穩(wěn)態(tài)的維持調(diào)節(jié)有關(guān)。

2.1 STC2與腫瘤

越來越多的研究表明，STC2的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與正常的組織相比，STC2在多種惡性腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)，且STC2在不同的腫瘤組織中發(fā)揮雙向作用。如在鼻咽癌、成纖維細(xì)胞瘤、食管鱗癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌等起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展作用，而在乳腺癌中起抑制癌癥作用。在結(jié)直腸癌[3]組織中，與相應(yīng)的正常組織相比，STC2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著升高，且STC2高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總生存期較短。CHEN Bing等人[4]研究發(fā)現(xiàn)STC2通過激活MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和EMT進(jìn)展。YUAN Qiong等人[5]研究發(fā)現(xiàn)STC2可通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)P-glycoprotein，而使得結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性下降，從而產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。多種研究說明STC2有可能通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胃癌[6]中，STC2高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床晚期顯著相關(guān)，STC2高表達(dá)的患者較STC2不表達(dá)的患者生存期顯著降低5年。乳腺癌對(duì)女性健康的威脅非常大，Joensuu等人[7]研究發(fā)現(xiàn)，在72例原發(fā)性乳腺癌的免疫組化中，STC2高表達(dá)患者比STC2低表達(dá)患者生存率高5～10年，同時(shí)在10年內(nèi)復(fù)發(fā)率也較低。提示STC2高表達(dá)的乳腺癌患者擁有較長的無病生存期且預(yù)后較好。許多項(xiàng)研究表明，STC2與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有著非常密切的關(guān)聯(lián)，這也許會(huì)成為潛在的治療乳腺癌的靶點(diǎn)，為乳腺癌的治療提供理論指導(dǎo)。

2.2 STC2與妊娠

對(duì)不同生理狀態(tài)下的妊娠早期大鼠子宮STC2表達(dá)和調(diào)節(jié)進(jìn)行研究，在第1天和第5天在子宮腔上皮分別檢測到基礎(chǔ)水平的STC2 mRNA表達(dá)。從第2天開始mRNA免疫染色逐漸開始增強(qiáng)，第5天達(dá)高峰。在妊娠第6天，可觀察到高水平的mRNA表達(dá)。延遲著床時(shí)，在子宮檢測到基礎(chǔ)水平的STC2 mRNA表達(dá)，經(jīng)雌激素處理正常著床后，著床部位圍繞著胚泡的腔上皮細(xì)胞STC2 mRNA被顯著誘導(dǎo)，可以觀察到高水平的STC2免疫染色。做胚胎移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步可以證明，著床部位STC2的表達(dá)可被植入的胚泡所誘導(dǎo)。在整個(gè)蛻膜期(從妊娠的第7～9天)蛻膜細(xì)胞中都觀察到STC2免疫染色，但STC2蛋白僅在第7天和第8天的原始蛻膜期被觀察到，在第9天表達(dá)量最高。對(duì)大鼠進(jìn)行人工蛻膜處理，可檢測到強(qiáng)的mRNA信號(hào)，明顯高于對(duì)照組。這與正常妊娠過程一致。提示，STC2可能在大鼠著床和蛻膜過程中起某些作用[8]，但具體作用機(jī)理未見報(bào)道。

2.3 STC2與骨骼和體型大小

STC2在骨組織中高表達(dá)。Takei等[9]的研究表明，STC2的表達(dá)同樣受到體內(nèi)Pi的調(diào)控，對(duì)維持正常的骨骼發(fā)育十分重要。骨細(xì)胞分泌的磷酸鹽調(diào)節(jié)激素Fgf23基因敲除小鼠的平滑肌細(xì)胞中，受胞外無機(jī)Pi刺激STC2 mRNA表達(dá)顯著增高，同時(shí)伴隨骨鈣素和骨橋蛋的高表達(dá)。

Jepsen等人[10]通過研究發(fā)現(xiàn)STC2可以與妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)共價(jià)結(jié)合，抑制其蛋白水解活性，導(dǎo)致胰島素樣生長因子蛋白不能被裂解，失去活性，使哺乳動(dòng)物不能正常生長。Gagliardi等人[11]通過構(gòu)建hSTC2轉(zhuǎn)基因小鼠品系，對(duì)小鼠STC2基因表達(dá)分析表明，它在發(fā)育過程中不高度表達(dá)，但在成年小鼠心臟和骨骼肌表現(xiàn)出最高的STC2 mRNA穩(wěn)態(tài)水平。STC2過表達(dá)的小鼠早在胚胎發(fā)育12.5 d就顯示宮內(nèi)生長受限和發(fā)育遲緩表型和嚴(yán)重的出生后生長遲緩，進(jìn)而使得hSTC2轉(zhuǎn)基因小鼠比同窩出生的野生型小鼠體型上小約45%。STC2誘導(dǎo)的可能是侏儒表型，睪丸器官腫大，骨骼肌質(zhì)量顯著減少。而且他的實(shí)驗(yàn)還得出hSTC2誘導(dǎo)的嚴(yán)重生長遲緩與GH或IGF表達(dá)的降低無關(guān)。因此，STC2可以作為有效的生長抑制劑并減少膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨發(fā)育以及骨骼肌生長，這也意味著這些組織是斯鈣素的特定生理靶點(diǎn)。

2.4 STC2在家畜上的研究進(jìn)展

2.4.1 在犬上 犬最顯著的表型性狀是體型的大小，在韋云芳等人關(guān)于犬體型大小相關(guān)基因的研究中發(fā)現(xiàn)，STC2是一種犬體型大小相關(guān)基因之一，它的變異會(huì)導(dǎo)致其體型的變小[12]。2017年發(fā)表在權(quán)威期刊《自然》上的一篇文章，研究發(fā)現(xiàn)了83個(gè)新的影響人類身高的基因變化。還發(fā)現(xiàn)了以前未知的幾個(gè)與骨骼生長相關(guān)的生物學(xué)途徑的基因，其中一個(gè)是STC2，STC2基因的兩種不同的變異，都對(duì)身高產(chǎn)生很大的影響。雖然這兩種變異很罕見，但有一種變異會(huì)讓人高出1～2 cm[13]。早在2013年Law等的一項(xiàng)研究表明，STC2可促進(jìn)VEGF表達(dá)(血管內(nèi)皮生長因子，簡稱VEGF)，或許可以應(yīng)用靶向療法(如VEGF促進(jìn)劑)，作為一種潛在的藥物靶點(diǎn)來幫助身材矮小的人[14]。

2.4.2 在羊上 Zhu等人[15]在體外研究了STC2對(duì)山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMECs)凋亡、增殖和泌乳的影響及其調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明，STC2在體外能促進(jìn)GMECs增殖并抑制其凋亡。高表達(dá)STC2通過ELISA的方式可以激活Ras/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)增殖并增強(qiáng)GMECs中β-酪蛋白和甘油三酯的合成，促進(jìn)泌乳。Fan等人[16]在絨山羊毛發(fā)生長周期的研究進(jìn)展中表明，STC2在山羊毛囊中表達(dá)，是一個(gè)毛發(fā)生長基因，促進(jìn)毛囊細(xì)胞的增殖在毛囊周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。為研究STC2對(duì)體外奶山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(EECs)的影響。Cui和Liu等人[17]構(gòu)建了STC2過表達(dá)載體(pc3.1-STC2)，用pc3.1-STC2轉(zhuǎn)染EECs后，STC2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，EDU和CCK-8檢測結(jié)果顯示STC2能顯著促進(jìn)EECs的增殖；此外，細(xì)胞凋亡試驗(yàn)表明，STC2顯著抑制EECs細(xì)胞凋亡，Western Blot(WB)分析結(jié)果顯示STC2顯著性下調(diào)BAX表達(dá)并上調(diào)BCL2表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是子宮內(nèi)膜接受性生物標(biāo)志物，在小鼠接受性子宮內(nèi)膜(RE)的建立中起重要作用，WB分析顯示STC2的過表達(dá)降低了VEGF，而對(duì)STC2的干擾則增加了VEGF，預(yù)測STC2通過體外調(diào)節(jié)VEGF參與奶山羊RE的建立，而RE的建立是胚胎著床最關(guān)鍵的一步。然而，在體內(nèi)，STC2在奶山羊子宮內(nèi)膜容受性中的發(fā)展還需進(jìn)一步研究。

2.4.3 在牛上 Mith等[18]對(duì)美國Gelbvieh牛進(jìn)行生長性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAA)，揭示了在染色體BTA20上，Gelbvieh生長性狀的多效QTL的常見位置候選基因是STC2，STC2是最接近BTA20上QTL的基因，而STC2本身也是一個(gè)與小鼠，犬生長性狀相關(guān)的基因。最近在美國安格斯牛、SimAngus和赫里福德牛的飼料效率和生長性狀中也檢測到了針對(duì)Gelbvieh生長性狀的QTL，STC2與染色體BTA20上的QTL區(qū)域最接近，STC2也是優(yōu)先考慮共同的位置候選基因[19]。在轉(zhuǎn)基因小鼠中STC2的過度表達(dá)會(huì)減少膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨發(fā)育和骨骼肌生長，并致侏儒表型。STC2也已被證明是野生型小鼠出生后生長的有效負(fù)調(diào)節(jié)劑。預(yù)測STC2可能是一個(gè)與肉牛生長性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記。

3 小結(jié)與展望

最早認(rèn)識(shí)STC2的功能是參與礦物質(zhì)鈣、磷代謝的調(diào)節(jié)，近來發(fā)現(xiàn)STC2在人腫瘤疾病，小鼠妊娠，骨骼生長，犬體型大小方面也有重要作用。STC2逐漸成為一種新的腫瘤標(biāo)記生物分子。STC2在家畜犬上是一個(gè)生長性狀相關(guān)基因，在羊上影響山羊EECs的增殖，促進(jìn)泌乳，體外促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮的增殖，促進(jìn)形成接受性子宮內(nèi)膜，從而有利于胚胎著床，但在體內(nèi)試驗(yàn)研究未見報(bào)道。在牛上，STC2是一個(gè)生長性狀相關(guān)多效QTL的常見位置候選基因，但是對(duì)于STC2基因是通過調(diào)節(jié)哪一個(gè)或者哪幾個(gè)生長性狀，以何種方式調(diào)節(jié)及具體機(jī)制尚待研究。插入缺失標(biāo)記(InDel)是基于插入缺失位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的標(biāo)記，可利用便捷的電泳平臺(tái)進(jìn)行分型，并且分型準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，避免了由于特異性和復(fù)雜性導(dǎo)致的后續(xù)分析模糊。故借助InDel方法對(duì)家畜生長性狀相關(guān)候選基因進(jìn)行篩選已被廣泛應(yīng)用。所以，人們可以在我國黃牛群體中，以STC2基因?yàn)楹蜻x基因，研究黃牛STC2基因InDel、CNV和SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，分析其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，以期找到STC2基因與肉牛生長性狀的關(guān)聯(lián)性和分子標(biāo)記，為肉牛品種選育提供理論基礎(chǔ)。也為在肉牛上對(duì)STC2基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制和作用研究奠定基礎(chǔ)。