環(huán)二鳥苷酸在生物膜形成中作用的研究進(jìn)展

馮 媛， 王 惠， 王崇剛

作者單位： 山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染性疾病科，太原030001。

耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn)和傳播嚴(yán)重威脅人類健康[1]。生物膜是導(dǎo)致耐藥的一種重要機(jī)制，并且多數(shù)細(xì)菌感染與之相關(guān)。生物膜通過一系列不同的機(jī)制，使生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗生素和消毒劑的抵抗能力顯著高于浮游菌，如生物膜基質(zhì)對(duì)抗生素的抗?jié)B性、生物膜核心部位細(xì)菌的生長(zhǎng)速率降低、存在耐受抗生素的持留菌和生物膜內(nèi)細(xì)菌外排泵過表達(dá)，并引起持續(xù)感染，是治療失敗的主要原因[2]。臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究表明，大多數(shù)情況下，僅抗生素治療不足以根除生物膜感染[3]，因此抑制生物膜形成的藥物將是目前臨床治療中的重要補(bǔ)充[4]。環(huán)二鳥苷酸[Bis-（3'， 5'） cyclic diguanylic acid, c-di-GMP]是一種普遍存在于細(xì)菌中重要的第二信使，在協(xié)調(diào)細(xì)菌生長(zhǎng)和行為各個(gè)方面均有重要作用，包括運(yùn)動(dòng)、毒力、生物膜形成和細(xì)胞周期等[5]。干擾和調(diào)節(jié)c-di-GMP可能是控制生物膜形成的重要措施。本綜述對(duì)c-di-GMP結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)節(jié)，在生物膜形成中的作用及相關(guān)治療作介紹。

1 c-di-GMP結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)、功能

c-di-GMP是環(huán)二核苷酸 （CDN）中最早被發(fā)現(xiàn)、研究最多、作用廣泛且普遍存在的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子[5]。最初在木糖葡糖桿菌中作為纖維素合成酶的變構(gòu)激活劑被人類發(fā)現(xiàn)并定義[6]，隨后在大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)。c-di-GMP單體具有兩重對(duì)稱性，兩個(gè)GMP基團(tuán)由一個(gè)5'，3'大環(huán)融合而成。c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)包括四部分，即合成c-di-GMP的二鳥苷酸環(huán)化酶（DGC）、降解c-di-GMP的磷酸二酯酶（PDE）、c-di-GMP效應(yīng)分子及受效應(yīng)分子直接調(diào)控的下游靶標(biāo)[7]。細(xì)菌內(nèi)存在與c-di-GMP代謝酶結(jié)構(gòu)類似并且具有感受結(jié)構(gòu)域的分子，可以感知細(xì)菌內(nèi)外信號(hào)，調(diào)節(jié)c-di-GMP代謝酶活性，進(jìn)而影響c-di-GMP水平。不同水平c-di-GMP通過介導(dǎo)其效應(yīng)分子及下游靶標(biāo)發(fā)揮作用，參與細(xì)菌多種生理功能。目前已經(jīng)被鑒定的c-di-GMP效應(yīng)分子有mRNA核糖開關(guān)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、含有PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、以及含有退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。

細(xì)菌內(nèi)c-di-GMP水平受到DGC和PDE嚴(yán)格調(diào)控，并且這種調(diào)控既有全局層面又有局部層面[7]。一般來說，低/高水平c-di-GMP分別與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和生物膜形成相關(guān)。c-di-GMP由DGC催化2分子GTP縮合形成，并通過PDE水解為2分子GMP或線性pGpG。PDE含有EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域，而大部分DGC具有GGDEF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域上存在DGC的催化活性位點(diǎn)（A-site）和變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)（I-site）。當(dāng)c-di-GMP以二聚體形式與I位點(diǎn)結(jié)合，DGC的活性受到產(chǎn)物非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，這有助于維持c-di-GMP水平的穩(wěn)定[8]。

生物膜形成是細(xì)菌感染遷延不愈的主要原因。體外研究表明外源性c-di-GMP可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成，但無明顯抗微生物活性。然而Brouillette等[9]卻發(fā)現(xiàn)c-di-GMP在體內(nèi)具有抗微生物活性，可以減少小鼠乳腺炎模型中金黃色葡萄球菌的定植，并呈劑量依賴性，200 nmoL c-di-GMP基本可以清除乳腺中的金黃色葡萄球菌[乳腺組織中菌落形成單位（CFU）減少為原來的萬分之一，P＜0.001]。c-di-GMP具有抗微生物活性可能是其在體內(nèi)引起宿主免疫應(yīng)答的結(jié)果，Karaolis等[10]的研究為此提供了依據(jù)，他們提出c-di-GMP是一種免疫刺激分子，可以觸發(fā)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。與之前實(shí)驗(yàn)不同，該研究通過用c-di-GMP對(duì)小鼠乳腺預(yù)處理（細(xì)菌接種前12 h和6 h），發(fā)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌感染有顯著的保護(hù)和預(yù)防作用（乳腺組織中CFU減少為原來的萬分之一，P＜0.001），認(rèn)為該保護(hù)作用可能是c-di-GMP觸發(fā)固有免疫應(yīng)答的結(jié)果。隨后進(jìn)一步研究了c-di-GMP對(duì)宿主免疫應(yīng)答的影響，基于以下發(fā)現(xiàn)，提出c-di-GMP可以觸發(fā)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答：c-di-GMP可以激活人樹突細(xì)胞的p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的成熟（表達(dá)成熟標(biāo)志物、招募效應(yīng)細(xì)胞、刺激T細(xì)胞增殖）；另外c-di-GMP還具有佐劑潛力，可以顯著提高抗體滴度，以IgG2a為主，并在小鼠細(xì)菌性肺炎模型再次證明c-di-GMP可以觸發(fā)固有免疫應(yīng)答[11]。Zhao等[12]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)c-di-GMP預(yù)處理也可以減少鮑曼不動(dòng)桿菌在小鼠模型的肺部定植，并且是通過誘導(dǎo)MCP-1等趨化因子，招募嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的。目前對(duì)c-di-GMP調(diào)控免疫的研究十分有限，但c-di-GMP的免疫調(diào)控功能將有望在對(duì)抗細(xì)菌感染方面發(fā)揮重要作用。

2 c-di-GMP在生物膜形成各階段的作用

典型的生物膜形成周期包括四部分：①細(xì)菌附著在生物或非生物表面上；②細(xì)菌失去運(yùn)動(dòng)能力，開始產(chǎn)生生物膜基質(zhì)，形成生物膜；③生物膜成熟和增厚；④生物膜擴(kuò)散（隨著生物膜的老化，細(xì)菌從生物膜中擴(kuò)散，恢復(fù)到浮游狀態(tài)，生命周期重新開始）。生物膜的形成存在多種調(diào)節(jié)機(jī)制，其中c-di-GMP在生物膜的形成和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，一直是研究關(guān)注的焦點(diǎn)。生物膜的形成過程包括表面附著、運(yùn)動(dòng)控制[游泳（swimming）、群集運(yùn)動(dòng)（swarming）、顫動(dòng)（twiching）]、生物膜基質(zhì)的產(chǎn)生、生物膜擴(kuò)散，這些都與c-di-GMP水平有關(guān)[13]。

2.1 附著與運(yùn)動(dòng)

細(xì)菌在表面的初始可逆附著需要依靠不同運(yùn)動(dòng)方式來實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌在水溶性/半固體/非生物表面的運(yùn)動(dòng)方式分別是游泳、群集、顫動(dòng)。鞭毛和菌毛是介導(dǎo)這三種運(yùn)動(dòng)方式的細(xì)胞器，它們的合成、組裝及功能均受到c-di-GMP高度調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子FleQ是一種細(xì)菌AAA+ATP酶增強(qiáng)結(jié)合蛋白，是銅綠假單胞菌鞭毛基因的主要激活因子，當(dāng)c-di-GMP高水平時(shí)，c-di-GMP與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FleQ使其ATP酶活性降低，抑制鞭毛基因轉(zhuǎn)錄[14]。Trampari等[15]發(fā)現(xiàn)c-di-GMP可以調(diào)控鞭毛的輸出，鞭毛的輸出裝置由6個(gè)膜蛋白和3個(gè)可溶性蛋白FliI與FliH和FliJ構(gòu)成，其中FliI ATP酶活性對(duì)鞭毛輸出裝置的啟動(dòng)有重要作用，而c-di-GMP與FliI結(jié)合進(jìn)而抑制鞭毛的輸出。c-di-GMP通過對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)功能調(diào)控進(jìn)而介導(dǎo)表面黏附及生物膜擴(kuò)散。例如，大腸埃希菌和腸血清型傷寒沙門菌，c-di-GMP通過效應(yīng)分子YcgR（PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)）調(diào)控游泳運(yùn)動(dòng)。高水平c-di-GMP與YcgR結(jié)合，并以結(jié)合形式與鞭毛馬達(dá)定子MotA相互作用，影響馬達(dá)運(yùn)轉(zhuǎn)及能量產(chǎn)生，進(jìn)而抑制游泳運(yùn)動(dòng)，而細(xì)菌內(nèi)PdeH（PDE）可以水解c-di-GMP，使其處于低水平來維持游泳運(yùn)動(dòng)[16]。類似的機(jī)制在枯草芽孢桿菌也存在[17]。群集運(yùn)動(dòng)是由鞭毛和菌毛共同介導(dǎo)的，YcgR類似物FlgZ通過調(diào)控銅綠假單胞菌鞭毛控制群集運(yùn)動(dòng)，高水平c-di-GMP與FlgZ結(jié)合，并與鞭毛定子MotC的相互作用，阻止鞭毛定子復(fù)合物MotCD與轉(zhuǎn)子接觸來抑制群集運(yùn)動(dòng)[18]。c-di-GMP代謝酶SadC、SadB、BifA均與群集運(yùn)動(dòng)有關(guān)，sadB位于sadC下游，研究發(fā)現(xiàn)sadC、sadB基因缺失會(huì)導(dǎo)致群集運(yùn)動(dòng)上調(diào)，相反bifA基因缺失引起群集運(yùn)動(dòng)喪失，目前認(rèn)為SadC、BifA可能共同調(diào)節(jié)c-di-GMP水平，進(jìn)而通過SadB控制群集運(yùn)動(dòng)[19-20]。銅綠假單胞菌的顫動(dòng)是由菌毛通過延伸、附著、收縮的循環(huán)介導(dǎo)。過去發(fā)現(xiàn)具有GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域的FimX與顫動(dòng)有關(guān)[21]，最近研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP通過與FimX和PilZ形成三聚體復(fù)合物調(diào)控菌毛生成，進(jìn)而控制顫動(dòng)[22]，但具體機(jī)制仍不清楚。

2.2 生物膜基質(zhì)的產(chǎn)生

初始附著后，細(xì)菌增殖并產(chǎn)生生物膜基質(zhì)形成成熟的生物膜。生物膜基質(zhì)在不同細(xì)菌中成分存在差異。c-di-GMP在生物膜基質(zhì)的不同成分產(chǎn)生過程中發(fā)揮調(diào)控作用，如銅綠假單胞菌已鑒定的生物膜基質(zhì)成分主要有多糖Psl、Pel和海藻酸鹽。轉(zhuǎn)錄因子FleQ與c-di-GMP的結(jié)合形式激活pel和psl基因轉(zhuǎn)錄，并且這些多糖受到PelD（一種退化的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白）以及幾種DGC和PDE酶在翻譯后調(diào)控[14,23]。海藻酸鹽不是生物膜形成的必需成分，但由于其能維持細(xì)胞水化，在限制水的條件下是生物膜形成所必需的組成部分[24-25]，因此，在肺囊性纖維化感染中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)肺囊性纖維化患者的氣道呈脫水狀態(tài)，這會(huì)促使銅綠假單胞菌從非黏液表型轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生海藻酸鹽的黏液表型，引起患者肺功能和生存率的下降[26]。由此可見抑制海藻酸鹽的生成有助于控制肺囊性纖維化患者的感染，并改善預(yù)后。海藻酸鹽是由多種蛋白復(fù)合物參與合成的，其前體經(jīng)內(nèi)膜蛋白Alg8和Alg44（PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白）聚合，在細(xì)胞周質(zhì)被多種蛋白修飾及裝運(yùn)，隨后被分泌出細(xì)胞外發(fā)揮作用。過去研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP與Alg44結(jié)合可以激活海藻酸鹽的合成，而這種激活依賴另一種內(nèi)膜蛋白MucR（混合的EAL-GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白）對(duì)局部c-di-GMP水平的調(diào)節(jié)。最近研究發(fā)現(xiàn)MucR介導(dǎo)硝酸鹽依賴的海藻酸鹽合成，并且GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域?qū)τ诤Ｔ逅猁}的合成均有重要作用[27]。

大腸埃希菌的生物膜基質(zhì)卷曲纖維、纖維素和（β-1,6-N）-乙酰氨基葡萄糖（PGA）的合成也受到c-di-GMP調(diào)節(jié)。其中纖維素的合成過程存在c-di-GMP全局層面與局部層面的調(diào)控。RpoS（σ因子）誘導(dǎo)DgcE表達(dá)上調(diào)和PdeH的連續(xù)下調(diào)，引起細(xì)菌c-di-GMP整體水平升高。DgcM和PdeR構(gòu)成局部控制模塊，主要感應(yīng)c-di-GMP水平升高，并激活轉(zhuǎn)錄因子MlrA，而非調(diào)節(jié)c-di-GMP水平[28]。活化的MlrA會(huì)激活中央卷曲調(diào)節(jié)器CsgD，進(jìn)而誘導(dǎo)卷曲基因和dgcC的表達(dá)，前者合成卷曲纖維，后者合成DgcC使c-di-GMP局部水平升高，進(jìn)而c-di-GMP通過與纖維素合成酶BcsA-BcsB結(jié)合使之變構(gòu)激活合成纖維素[29]。PGA存在于多種細(xì)菌的生物膜基質(zhì)中，在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)后被命名為PGA，可以促進(jìn)表面黏附和生物膜形成[30]。PGA的合成、分泌都需要c-di-GMP對(duì)PGA復(fù)合物變構(gòu)激活。該復(fù)合物包括兩種跨膜組分PgaA和PgaB，兩種內(nèi)膜組分PgaC和PgaD。pgaA基因（編碼PGA復(fù)合物）以及編碼DgcT和DgcZ兩個(gè)DGC分子的基因dgcT和dgcZ都由Csr（carbon storage regulation system）控制，這是一個(gè)介導(dǎo)大腸埃希菌多種生理功能的碳儲(chǔ)存調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括CsrA、CsrB、CsrC，其中CsrA對(duì)上述基因起抑制作用，而CsrB、CsrC對(duì)CsrA也存在抑制作用[31]。組氨酸激酶BarA受短鏈脂肪酸（醋酸或富馬酸）的刺激，通過應(yīng)答調(diào)節(jié)因子UvrY的磷酸化激活兩個(gè)sRNA CsrB和CsrC的表達(dá)，抑制CsrA，從而使pgaA、dgcT、dgcZ基因表達(dá)，c-di-GMP水平升高，合成并分泌PGA。最近研究表明PgaCD是一種新型c-di-GMP受體，c-di-GMP可以直接與PgaC和PgaD結(jié)合激活PGA合成及分泌[32]。

2.3 生物膜擴(kuò)散

隨著生物膜老化，生物膜內(nèi)的細(xì)菌擴(kuò)散為浮游菌，并在其他地方形成生物膜，導(dǎo)致感染的遷延和慢性化，但浮游菌恢復(fù)了對(duì)抗生素的敏感性，有利于發(fā)揮抗生素治療效果清除病原菌及病灶。這將為治療生物膜相關(guān)感染提供一個(gè)新的思路。Morgan等[33]認(rèn)為生物膜擴(kuò)散是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、受到高度調(diào)控的過程，其由特定的環(huán)境信號(hào)觸發(fā)，并受尚未表征的基因分層控制。Christensen等[34]通過過表達(dá)磷酸二酯酶基因yhjH，證實(shí)降低c-di-GMP水平可引起生物膜在體內(nèi)外擴(kuò)散。而一氧化氮（NO）和谷氨酸也被證明可以引起生物膜擴(kuò)散，并與低水平c-di-GMP有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)dipA、rbdA、bdlA基因在NO或谷氨酸誘導(dǎo)生物膜擴(kuò)散中具有重要作用，但細(xì)菌如何感知環(huán)境信號(hào)（如NO），以及該信號(hào)如何引起c-di-GMP水平變化進(jìn)而調(diào)控生物膜擴(kuò)散尚不了解。最近研究發(fā)現(xiàn)在谷氨酸誘導(dǎo)擴(kuò)散模型中，NicD可以感知谷氨酸信號(hào)，引起c-di-GMP水平升高進(jìn)而順序激活BdlA（一種傳感器蛋白）和DipA（GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域蛋白），最終引起c-di-GMP水平降低介導(dǎo)生物膜擴(kuò)散[35]。對(duì)于c-di-GMP調(diào)控的生物膜擴(kuò)散可能存在兩種情況：①依賴游泳運(yùn)動(dòng)的主動(dòng)逃逸，這與鞭毛基因表達(dá)上調(diào)及菌毛基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)；②生物膜黏附性降低及生物膜基質(zhì)合成減少引起的被動(dòng)脫落[33]。Chatterjee等[36]在熒光假單胞菌中發(fā)現(xiàn)c-di-GMP調(diào)控黏附素LapA介導(dǎo)生物膜擴(kuò)散。LapA結(jié)合在細(xì)胞膜上，介導(dǎo)表面黏附，維持生物膜穩(wěn)定；LapG是一種周質(zhì)蛋白酶，可切割LapA；LapD是一種跨膜蛋白，可調(diào)節(jié)LapG的活性。高水平c-di-GMP可與LapD結(jié)合，將LapG隔離在周質(zhì)中使其不能切割LapA進(jìn)而發(fā)揮黏附素作用。但c-di-GMP與磷酸鹽水平相關(guān)，當(dāng)磷酸鹽不足時(shí)，c-di-GMP水平因RapA（PDE）表達(dá)而降低，LapD失活，LapG釋放并切割LapA，促進(jìn)生物膜擴(kuò)散。目前關(guān)于c-di-GMP在生物膜擴(kuò)散中機(jī)制研究尚較少，但是依據(jù)c-di-GMP在運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)以及生物膜基質(zhì)產(chǎn)生中發(fā)揮的作用，推測(cè)它在生物膜擴(kuò)散中的作用必不可少。已經(jīng)證實(shí)調(diào)節(jié)c-di-GMP水平，誘導(dǎo)生物膜擴(kuò)散可以作為一種感染控制策略，接下來需要大量實(shí)驗(yàn)加以佐證及深入研究，希望成為解決生物膜感染的一條途徑。

3 c-di-GMP與生物膜治療

c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)通路與細(xì)菌的多種生理功能密切相關(guān)，因此，調(diào)節(jié)c-di-GMP水平、阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于研發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。目前阻斷c-di-GMP信號(hào)傳導(dǎo)有三類潛在靶點(diǎn)，即c-di-GMP合成酶抑制劑、c-di-GMP降解酶抑制劑、c-di-GMP受體抑制劑[7]。如，Sambanthamoorthy等[37]利用霍亂弧菌中高水平c-di-GMP抑制熒光素酶 VC1673-lux表達(dá)這一特性，篩選出7個(gè)能抑制霍亂弧菌生物膜形成的雙鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，其中一個(gè)分子DI-3表現(xiàn)出廣譜抗生物膜活性。該研究者通過基于藥效基團(tuán)的高通量方法篩選出4個(gè)雙鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)其不僅可以抑制生物膜形成，還可以使已經(jīng)形成的生物膜擴(kuò)散[38]。目前還未發(fā)現(xiàn)c-di-GMP降解酶抑制劑和c-di-GMP受體抑制劑存在抗生物膜作用。另外，PDE激活劑可通過降解c-di-GMP誘導(dǎo)生物膜擴(kuò)散，Christensen等[34]證明此概念。NO在亞致死濃度下可通過結(jié)合NO敏感 H-NOX結(jié)構(gòu)域蛋白，激活PDE而誘導(dǎo)多種細(xì)菌擴(kuò)散，并且硝基氧化物（NO供體）與環(huán)丙沙星結(jié)合使用可有效地根除生物膜[39]。小劑量NO吸入在感染銅綠假單胞菌的肺囊性纖維化患者中可明顯減少生物膜并提高治療效果[40]。以上研究說明NO作為PDE激活劑，與抗生素聯(lián)合使用可能是治療生物膜相關(guān)感染的可行方法。但是需要探索安全、有效的誘導(dǎo)生物膜擴(kuò)散的藥物，然而，并不是所有的PDE都能調(diào)控生物膜的擴(kuò)散，重要的是確保激動(dòng)劑正確地激活具有已知擴(kuò)散作用的PDE。此外，鑒于c-di-GMP可以觸發(fā)先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，具有預(yù)防和控制感染的作用，c-di-GMP將有望成為疫苗，在預(yù)防和控制感染方面發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)

生物膜的形成使細(xì)菌能夠適應(yīng)各種不利的環(huán)境，因此也對(duì)臨床上治療造成極大困擾。近年來研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP通過與多種效應(yīng)分子相互作用形成一個(gè)信息網(wǎng)絡(luò)，參與并影響細(xì)菌的代謝及多種生理功能，尤其是在生物膜形成中，因此c-di-GMP可以作為抗生物膜藥物的作用靶點(diǎn)。到目前為止，c-di-GMP對(duì)生物膜形成等多種生理功能的具體調(diào)控通路仍不明確,并且c-di-GMP的免疫調(diào)節(jié)功能、生物膜擴(kuò)散、c-di-GMP抑制劑方面研究較少，仍需大量研究探索及佐證，這將可以對(duì)生物膜引起的感染提供一個(gè)治療新思路。