血清CA153、miR-10b 在早期乳腺癌診斷中的價值

程 文 潘廣銳 曾安貴 王 毅 李 攀

1.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院 攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川攀枝花 617067；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康健城院區(qū)乳腺外科，四川瀘州 646000

2018 年全球乳腺癌發(fā)病率和死亡率分別排在第二位和第四位[1]，近年來乳腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增長，嚴重影響人們的生命健康[2]。乳腺癌早期癥狀不典型，僅有25%的患者處于Ⅰ期時被發(fā)現(xiàn)，而約70%的患者到晚期才被確診，因此提高早期乳腺癌的檢出率尤為重要[3]。糖類抗原153（CA153）是一種血型抗原，在卵巢癌和肝癌患者中CA153 高表達，且與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。微小RNA（miR）是一類短鏈RNA，其能夠調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖和化療藥物耐藥性等，在腫瘤診斷中的臨床價值逐漸得到重視[6-8]。其中微小RNA-10b（miR-10b）在正常組織中低表達，研究報道顯示，在肝癌和宮頸癌等腫瘤當(dāng)中miR-10b 表達量上調(diào)，并且與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和增殖密切相關(guān)[9-10]。目前對于CA153、miR-10b 在早期乳腺癌中的作用仍然缺乏了解，本研究檢測血清CA153、miR-10b 水平，旨在探討其在早期乳腺癌患者中的水平及其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年2 月—2020 年2 月攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診治的79 例早期乳腺癌患者作為研究對象，并將其納入乳腺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷確診為乳腺癌[11]；②TNM 分期為0 期和Ⅰ期；③臨床資料完整；④行乳腺癌根治術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型腫瘤；②存在嚴重肝腎功能損傷；③入院前接受過放化療治療；④存在遠端轉(zhuǎn)移者。乳腺癌組年齡35～65 歲，平均（53.71±18.26）歲；雌激素受體（ER）陽性59 例，ER 陰性20 例；孕激素受體（PR）陽性62 例，PR 陰性17 例；人表皮生長因子受體2（HER2）陽性57 例，HER2 陰性22 例；49 例絕經(jīng)，30 例未絕經(jīng)；40 例腫瘤直徑≤3 cm，39 例腫瘤直徑＞3 cm；低分化患者20 例，高中分化患者59 例；TNM 分期0 期患者44 例，TNM 分期Ⅰ期患者35 例。選擇同期于我院進行健康體檢的42 名健康體檢者作為對照組，年齡37～66 歲，平均（54.02±17.89）歲；25 名絕經(jīng)，17 名未絕經(jīng)。兩組年齡和月經(jīng)狀態(tài)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。臨床研究開展均與患者和體檢人員簽署知情同意書，臨床研究開展經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 血清CA153 水平檢測 研究對象入院后抽取3 mL空腹靜脈血，室溫靜置1 h，5000 r/min 離心20 min，離心半徑12.5 cm。收集血清凍存于-80℃。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清CA153 水平，使用CA153 檢測試劑盒（美國Abcam 科技有限公司，貨號ab108633）檢測血清CA153 水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 血清miR-10b 表達水平檢測 使用血清總RNA 提取試劑盒（miR-Neasy Serum/Plasma Kit）和RNA 轉(zhuǎn)錄試劑盒（miScript ⅡRT Kit）完成總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄（均購自于德國凱杰公司），具體流程：將血清樣本2 mL 與Trizol 溶液充分混勻后室溫下靜置5 min，加入氯仿0.2 mL 振蕩以提取總RNA。采用Agilents RNA LabChip Bioanalyzer 儀（ARLC&2100B，購自美國Agilent 公司）驗純后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：RNA 1 μg，2×RT mix 12 μL、Random hexamers 1 μL，最后加入RNase Free H2O 5 μL；反應(yīng)條件：25℃持續(xù)時間5 min，50℃持續(xù)時間15 min，85℃持續(xù)時間5 min。U6 為內(nèi)參基因，上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-10b 上游引物序列：5’-CGCACAAATTCGGATCTACA-3’，下游引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-10b、U6 引物序列均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。于7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）上進行PCR 擴增：SYBR Taq Ⅱ10 μL，ROX Dye Ⅱ0.4 μL，U6 primer 1.6 μL，cDNA 2 μL，RNase Free H2O 6 μL；擴增條件：95℃持續(xù)10 s 變性，然后95℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)20 s，95℃持續(xù)1 min，共40 個循環(huán)；每個樣本均設(shè)3 個復(fù)孔后取平均值。miR-10b 相對表達量采用2-△△Ct表示，△Ct（miR-10b）=Ct（miR-10b）-Ct（U6），△△Ct=△Ct（miR-10b）-△Ct（校準(zhǔn)標(biāo)本）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清CA153、miR-10b 水平對早期乳腺癌的診斷價值。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象血清CA153、miR-10b 水平比較

乳腺癌組血清CA153、miR-10b 水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組研究對象血清CA153、miR-10b 水平比較（）

表1 兩組研究對象血清CA153、miR-10b 水平比較（）

注：CA153：糖類抗原153；miR-10b：微小RNA-10b

2.2 乳腺癌組患者血清CA153、miR-10b 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同ER、組織學(xué)分化及TNM 分期乳腺癌患者血清CA153 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。不同HER2、TNM 分期乳腺癌患者血清miR-10b 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌組患者血清CA153、miR-10b 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（）

表2 乳腺癌組患者血清CA153、miR-10b 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（）

注：ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；HER2：人表皮生長因子受體2；CA153：糖類抗原153；miR-10b：微小RNA-10b

2.3 血清CA153、miR-10b 對早期乳腺癌的診斷價值分析

CA153 聯(lián)合miR-10b 診斷早期乳腺癌的曲線下面積（AUC）、敏感度和特異度高于CA153、miR-10b單獨檢測，具體數(shù)據(jù)見表3，ROC 曲線見圖1。

表3 血清CA153、miR-10b 對早期乳腺癌的診斷價值分析

3 討論

圖1 血清CA153、miR-10b 對早期乳腺癌的診斷價值分析

乳腺癌是較為常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均排在婦科惡性腫瘤首位，對女性健康造成嚴重影響[12-15]。目前對乳腺癌的發(fā)病機制仍然缺乏了解，已有的研究報道顯示，腫瘤免疫逃逸、腸道微生物菌群失調(diào)、miR 調(diào)控機制以及促癌基因活化等因素均會造成乳腺癌的發(fā)生，其中miR 調(diào)控機制和促癌基因活化在乳腺癌診斷和治療中的臨床價值得到廣泛關(guān)注[16-17]。尋求與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miR和促癌基因并將其應(yīng)用于乳腺癌的診斷和治療中是今后乳腺癌研究的重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者血清CA153 水平異常升高，且與ER 表達、分化程度和TNM 分期有關(guān)。分析其原因可能是由于CA153 能夠促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Liu 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，糖基化修飾的CA153能夠活化絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路，進而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。由于絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖、細胞周期和腫瘤干細胞維持等過程，因此早期乳腺癌患者在血清CA153 水平升高的同時其糖基化水平升高，糖基化CA153 與腫瘤細胞表面的酪氨酸受體結(jié)合，進而活化絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路并促進乳腺癌細胞增殖[19]。由于乳腺癌分化程度與乳腺癌細胞增殖相關(guān)，因此CA153 促進乳腺癌細胞增殖會導(dǎo)致乳腺癌分化程度下降[20]。同時，黃增光等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，CA153 與ER 共定位于細胞膜上。CA153 屬于黏蛋白家族成員，是一種糖蛋白分子。ER與乳腺癌細胞增殖與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)，ER 陰性的乳腺癌細胞增殖能力異常提高。早期乳腺癌患者中CA153 與ER 結(jié)合并抑制ER 活性，進而解除ER 對乳腺癌細胞增殖的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致乳腺癌細胞增殖能力異常提高[22]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者血清miR-10b表達水平異常升高，且在HER2 陰性和TNM 分期Ⅰ期患者中表達水平異常升高。分析其原因可能是由于miR-10b能夠作用于抑癌基因的信使RNA，唐靜等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中Kruppel 樣因子4（KLF4）抑癌基因是miR-10b 直接作用靶點，miR-10b 與KLF4 信使RNA 結(jié)合并誘導(dǎo)其降解，導(dǎo)致KLF4 基因表達下調(diào)，因此在乳腺癌中miR-10b 能夠抑制抑癌基因的表達，阻斷抑癌基因?qū)θ橄侔┌l(fā)生、發(fā)展的抑制作用，導(dǎo)致乳腺癌惡化[24]。HER2 陰性的乳腺癌細胞惡性程度較高，患者的預(yù)后較差。miR-10b 的作用機制主要包括兩個方面：一個方面，miR-10b 可以直接與信使RNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后修飾，進而調(diào)節(jié)基因表達；miR-10b抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[25-26]，因此在早期乳腺癌患者中miR-10b 可能與HER2 基因的信使RNA 結(jié)合而促進其降解，使HER2 表達下調(diào)。另一個方面，miR-10b 可能會抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成，導(dǎo)致HER2 基因的轉(zhuǎn)錄無法完成，最終導(dǎo)致HER2 表達下調(diào)[27]。目前對miR-10b 調(diào)節(jié)HER2 表達的分子機制仍然缺乏了解，需要進一步深入探究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CA153 聯(lián)合miR-10b 診斷早期乳腺癌的臨床價值高于CA153、miR-10b 單獨檢測，分析其原因可能是由于CA153 和miR-10b 并不是乳腺癌的特征性標(biāo)志物，在其他類型腫瘤中均能夠檢測到CA153 和miR-10b 異常表達，因此將CA153 和miR-10b 聯(lián)合診斷能夠有效提高其特異性，對早期乳腺癌的診斷價值也隨之提高。

綜上所述，早期乳腺癌患者血清CA153、miR-10b水平異常升高，血清CA153 與ER 表達、分化程度和TNM 分期有關(guān)，血清miR-10b 與HER2 表達和TNM分期有關(guān)，兩者聯(lián)合檢測在早期乳腺癌的診斷中具有一定臨床價值。