厄貝沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用及腎臟RAS 基因表達(dá)分析

陳思思 薛曉敏 李 毓 朱冰兒 陳力豪 吳 悅 吳人照

1.浙江省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究所，浙江杭州 310007；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053

全球高血壓患病率在逐年增加，專家預(yù)計(jì)到2025 年全球高血壓患者將上升達(dá)15 億人[1]。最新研究顯示中國(guó)成年人高血壓患病率已達(dá)27.9%[2]，是我國(guó)心腦血管疾病的首要危險(xiǎn)因素。高血壓可導(dǎo)致如心肌梗死和腦卒中等致命性心腦血管疾病[3]。據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告》統(tǒng)計(jì)報(bào)道[4]，2016 年我國(guó)因心血管病死亡例數(shù)占比達(dá)40%以上，死亡率高于腫瘤及其他疾病，嚴(yán)重危害國(guó)民健康。針對(duì)高血壓治療的藥物一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)，目前血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 （ACEI）、β-受體阻滯劑被JNC8等指南推薦為高血壓的首選用藥[5]。ARB 類藥物主要通過阻斷血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）與受體結(jié)合達(dá)到抗高血壓的作用，近年來其在臨床抗高血壓治療中應(yīng)用日益廣泛[6]。厄貝沙坦屬于ARB 類，在輕中度高血壓患者中，因其降壓效果優(yōu)于氯沙坦和纈沙坦[7]，臨床應(yīng)用最廣泛。目前尚未了解厄貝沙坦對(duì)SHR 大鼠降壓相關(guān)的基因表達(dá)情況的影響，因此，本實(shí)驗(yàn)以SHR 大鼠為研究對(duì)象，觀察厄貝沙坦對(duì)SHR 大鼠的血壓作用及ACE2、血管緊張素Ⅱ受體-1（AT1R）和AT2R mRNA 表達(dá)的情況，旨在為深入了解高血壓降壓機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

34 周以上（老齡）SHR 大鼠，Wistar 大鼠，雌性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證：SYXK（浙）2019-0010。實(shí)驗(yàn)過程遵循了單位和國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑

日本BP-98A 型無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x；美國(guó)Thermofisher Nano Drop 2000 核酸蛋白定量?jī)x；美國(guó)ABI Step One Plus 熒光定量PCR 儀；厄貝沙坦片購(gòu)自賽諾菲制藥有限公司；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（047A）、SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成引物。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后測(cè)量血壓，將SHR 大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組，每組6 只，另設(shè)6 只Wistar 大鼠為正常對(duì)照組。厄貝沙坦臨床上人的常用劑量為150 mg/d，按正常人體重60 kg 計(jì)算，劑量為2.5 mg/（kg·d），以人用劑量的6 倍作為大鼠的給藥劑量，即15 mg/（kg·d）。厄貝沙坦組每天灌胃15 mg/kg厄貝沙坦，模型組和正常對(duì)照組灌胃等量飲用水，給藥8 周，每周測(cè)量1 次給藥3 h 及24 h 的血壓，觀察收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的波動(dòng)變化。RT-qPCR檢測(cè)腎組織中ACE2、AT1R、AT2R 的表達(dá)情況。

1.4 測(cè)量血壓

將大鼠置恒溫水浴鍋上預(yù)熱，隨環(huán)境溫度的變化對(duì)加熱時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，使大鼠尾部血流量充盈便于血壓的測(cè)量。連通BP-98A 型無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x，并通過配套軟件讀取數(shù)據(jù)。每只大鼠在清醒安靜狀態(tài)下測(cè)量6～10 次血壓，其均值為測(cè)量所得值。

1.5 相關(guān)基因的表達(dá)情況

取腎臟組織100 mg，徹底勻漿后用Trizol 試劑提取總RNA 并測(cè)定濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，再采用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒檢測(cè)腎臟ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的表達(dá)量。其中PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBG 10 μL，H2O 6 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)；95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s 熔解曲線?；虻囊镄蛄芯唧w見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD-t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦不同給藥時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHR 大鼠SBP 的影響

厄貝沙坦組與模型組大鼠SBP 在給藥后3 h 和24 h 中，時(shí)間及交互作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），而組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2023.083、864.881，P ＜0.01）。厄貝沙坦組SBP 首次給藥，第2、4、6、8 周給藥后3 h 及24 h 低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。厄貝沙坦組SBP 在給藥后3 h 均有顯著下降，在給藥后24 h 有所回升，但仍低于治療前SBP。見表2。

表1 各基因引物序列

2.2 厄貝沙坦不同給藥時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHR 大鼠DBP 的影響

厄貝沙坦組與模型組DBP 在給藥后3 h 和24 h時(shí)，時(shí)間及交互作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），而組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=691.944、449.783，P ＜0.01）。厄貝沙坦組DBP 首次給藥后3 h低于模型組，第2、4、6、8 周給藥后3 h 及24 h 低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表3。

2.3 厄貝沙坦對(duì)SHR 大鼠腎臟中各基因相對(duì)表達(dá)量的影響

與模型組比較，厄貝沙坦組ACE2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，AT2R mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表4。

表2 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHR 大鼠SBP 的影響（mmHg，）

表2 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHR 大鼠SBP 的影響（mmHg，）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。SBP：收縮壓。1 mmHg=0.133 kPa

表3 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHR 大鼠DBP 的影響（mmHg，）

表3 厄貝沙坦片不同給藥時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHR 大鼠DBP 的影響（mmHg，）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。DBP：舒張壓。1 mmHg=0.133 kPa

表4 腎臟中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（）

表4 腎臟中ACE2、AT1R、AT2R mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05。ACE2：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2；AT1R：血管緊張素Ⅱ受體-1；AT2R：血管緊張素Ⅱ受體-2

3 討論

在降壓藥物研發(fā)過程中，谷峰比是其療效評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。谷峰比越高提示在24 h 內(nèi)藥物降壓作用越穩(wěn)定，有助于減少對(duì)靶器官的損傷[8-9]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)給藥3 h 的谷峰比最高，其降壓療效最穩(wěn)定，故本研究選擇在給藥3 h 和24 h 這兩個(gè)時(shí)間段測(cè)量血壓，以評(píng)價(jià)厄貝沙坦的最大降壓療效。

高血壓對(duì)機(jī)體的心腦腎等器官具有嚴(yán)重?fù)p害，其發(fā)生、發(fā)展過程中涉及多個(gè)系統(tǒng)的參與。研究顯示[10]，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是參與血壓調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)。Ang Ⅱ是RAS 的主要活性物質(zhì)，主要發(fā)揮收縮血管等作用[11]，主要作用于AT1R，小部分作用于AT2R[12]，其中AT1R 具有強(qiáng)烈的血管收縮作用，而AT2R介導(dǎo)的生物學(xué)作用與AT1R 相反，主要為利鈉作用，降低Na+在近曲小管中重吸收，保持Na+負(fù)平衡，進(jìn)一步降低血壓[13]。厄貝沙坦通過拮抗AT1R 抑制Ang Ⅱ介導(dǎo)的血管收縮和醛固酮的釋放，從而產(chǎn)生降壓作用。AT1R 和AT2R 在血壓調(diào)節(jié)中存在功能性相互作用，AT1R 阻斷后Ang Ⅱ增加導(dǎo)致其對(duì)立的AT2R 的刺激升高作用，本研究結(jié)果中AT1R 表達(dá)降低，而AT2R升高，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道結(jié)果一致。

近年來，ACE2 基因作為RAS 系統(tǒng)的新成員被廣泛研究，在體內(nèi)的主要作用是將Ang Ⅱ轉(zhuǎn)化為Ang（1-7），后者在體內(nèi)能引起血管擴(kuò)張，產(chǎn)生降血壓的作用從而維持機(jī)體正常的血壓平衡[15-16]。ACE2 對(duì)最初高血壓形成起重要作用，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[17-22]沙坦類或其他藥物可使高血壓大鼠腎臟和心肌組織的ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)增加，且多呈現(xiàn)出劑量依賴趨勢(shì)。而本研究卻發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦治療后ACE2 表達(dá)降低，推測(cè)可能與文獻(xiàn)[23]所提出的通路有關(guān)，厄貝沙坦選擇性與AT1R結(jié)合，此時(shí)循環(huán)中Ang Ⅱ反饋增加，Ang Ⅱ又可以通過激活信號(hào)分子ERK1/2 和p38 MAP 上調(diào)ACE 并下調(diào)ACE2 的表達(dá)。厄貝沙坦使機(jī)體內(nèi)血壓降到低點(diǎn)后，機(jī)體產(chǎn)生血壓調(diào)節(jié)的保護(hù)作用，不再需要ACE2 協(xié)同來發(fā)揮降血壓作用，從而厄貝沙坦組的ACE2 表達(dá)降低。由于本研究樣本量偏小，而且只設(shè)置了一個(gè)給藥濃度，后期可考慮多個(gè)給藥劑量，深入研究厄貝沙坦的劑量不同是否對(duì)ACE2 表達(dá)有所差異。盡管目前ACE2 的信號(hào)通路已經(jīng)很好地建立，但Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ACE2 的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍然不太明確，后期需要進(jìn)一步研究。