丁苯酞對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因及其相關(guān)X蛋白表達(dá)的影響

揭育東　林冬融

【摘要】 目的：觀察丁苯酞（Butylphthalide）對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)的影響，研究在糖尿病合并急性腦卒中患者的治療中，丁苯酞所發(fā)揮的作用機(jī)制。方法：選取70只雄性SD大鼠，以簡(jiǎn)單隨機(jī)數(shù)字法分為治療組（n=30）、對(duì)照組（n=30）及假手術(shù)組（n=10）。三組以無(wú)菌鏈脲佐菌素腹腔內(nèi)注射使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，分離右側(cè)頸動(dòng)脈后，重新縫合皮膚;治療組及對(duì)照組以栓線從右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈入口栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈閉塞及再灌注。再灌注30 min后，治療組以80 mg/（kg·d）丁苯酞?jiǎng)┝抗辔?，?duì)照組及假手術(shù)組給予等量食用麻油灌胃，連續(xù)給藥3 d。再灌注后72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，最后以TUNEL法計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)目，免疫組化檢測(cè)Bcl-2及Bax表達(dá)。結(jié)果：治療組神經(jīng)功能評(píng)分低于對(duì)照組（P<0.05）;治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組（P<0.05）;治療組的Bcl-2表達(dá)高于對(duì)照組，而B(niǎo)ax表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：丁苯酞對(duì)糖尿病合并急性腦梗死患者腦缺血半暗帶中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】 丁苯酞 糖尿病 腦梗死 B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白

[Abstract] Objective： To observe the effect of Butylphthalide on the expressions of Bcl-2 and Bax with focal cerebral ischemia-reperfusion injury in diabetes rats and to study the mechanism of Butylphthalide in the treatment of diabetic patients with acute stroke. Method： A total of 70 male SD rats were selected and divided into treatment group （n=30）， control group （n=30） and sham operation group （n=10） by simple random number method. The three groups were injected intraperitoneally with sterile Streptozotocin to make the experimental animals reach the diabetic standard. In the sham operation group， the skin of the right neck was cut open and the right carotid artery was separated， then the skin was re-sutured. In the treatment group and the control group， the right middle cerebral artery occlusion and reperfusion were achieved by embolizing the right middle cerebral artery from the right internal carotid artery entrance. 30 min after reperfusion， the treatment group was given 80 mg/ （kg·d） Butylphthalide by gavage， and the control group and sham operation group were given the same amount of edible sesame oil by gavage for?3 consecutive days. Neurological function score was performed 72 h after reperfusion. Finally， TUNEL method was used to calculate the number of apoptosis cells. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bcl-2?and Bax. Result： The neurological deficit score of the treatment group was lower than that of the control group （P<0.05）; the number of apoptotic neurons in the treatment group was less than that in the control group （P<0.05）; the expression of Bcl-2 in the treatment group was higher than that in the control group， while the expression of Bax in the treatment group was lower than that in the control group （P<0.05）. Conclusion： Butylphthalide may protect diabetes rats from neurons apoptosis after focal cerebral ischemia-reperfusion by promoting the expressions of Bcl-2 and inhibiting the expressions of Bax.

[Key words] Butylphthalide Diabetes Cerebral ischemia-reperfusion Bcl-2 Bax

First-author’s address： The Fifth Affiliated （Zhuhai） Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.19.008

缺血性腦血管病是中老年患者常見(jiàn)的高致殘率、高死亡率疾病。細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損的重要一環(huán)，同時(shí)亦是糖尿病促進(jìn)腦功能損害的其中一個(gè)關(guān)鍵原因[1]。丁苯酞能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮、促進(jìn)缺血區(qū)血管新生、改善微血管結(jié)構(gòu)和功能等機(jī)制來(lái)達(dá)到保護(hù)腦神經(jīng)元的作用[2]。本研究利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，探討在糖尿病合并急性腦卒中的治療中，丁苯酞所發(fā)揮的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠70只;分組：以簡(jiǎn)單隨機(jī)數(shù)字法分為治療組（30只）、對(duì)照組（30只）、假手術(shù)組（10只）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病造模 70只實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)前14 d以正常進(jìn)食進(jìn)水方式飼養(yǎng)，維持體重在250～300 g。實(shí)驗(yàn)前1晚禁食8 h，禁水6 h后，以左下腹腔注射5 mg/mL的無(wú)菌鏈脲佐菌素（STZ），劑量為2 mg/100 g。24 h后重復(fù)注射1次，劑量為3.5 mg/100 g。其后自由進(jìn)水進(jìn)食。7 d后選取非空腹血糖在16.7～25.6 mmol/L（尾尖外周血血糖）范圍內(nèi)的大鼠為造模成功的糖尿病大鼠。

1.2.2 大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注造模 假手術(shù)組大鼠在常規(guī)備皮、消毒鋪巾后，切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，分離右側(cè)頸動(dòng)脈后，重新縫合皮膚，以制造假手術(shù)狀態(tài)。治療組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)大鼠MCAO/R模型參照Z(yǔ)ea-longa法制作，以栓線栓塞右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，術(shù)后2 h將栓線外露殘端抽出退回至頸總動(dòng)脈以實(shí)現(xiàn)再灌注[3]。再灌注30 min后，治療組將丁苯酞稀釋于食用麻油中，以80 mg/（kg·d）劑量灌胃，連續(xù)給藥3 d;對(duì)照組及假手術(shù)組于同樣時(shí)間給予等量食用麻油灌胃。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 所有大鼠在手術(shù)后以正常進(jìn)食進(jìn)水方式飼養(yǎng)，治療組及對(duì)照組于腦缺血2 h并再灌注后72 h進(jìn)行評(píng)分。0、1分表現(xiàn)為大鼠四肢活動(dòng)完全正?；騼H左側(cè)上肢伸展欠佳，未達(dá)到造模成功標(biāo)準(zhǔn)。2分及以上表示造模成功，表現(xiàn)為大鼠左側(cè)肢體抵抗力下降、提尾行走或自行行走時(shí)僅右側(cè)肢體能活動(dòng)，身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或?qū)Υ碳o(wú)反應(yīng)。造模成功的大鼠于均于再灌注后72 h取腦進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。以上評(píng)分均按照Bederson 6級(jí)5分制為標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.2.4 凋亡細(xì)胞數(shù)檢測(cè) 采用TUNEL法，凋亡細(xì)胞的標(biāo)志為在顯微鏡下可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。凋亡細(xì)胞的計(jì)算方法：在顯微鏡下選擇右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)缺血半暗帶區(qū)內(nèi)互不重疊的5個(gè)顯微鏡視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞的算術(shù)平均值。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)Bcl-2及Bax表達(dá) Ⅰ抗分別為Bcl-2 Rabbit mAb及Bax Rabbit mAb，陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)志為細(xì)胞胞漿呈棕黃色。檢測(cè)方法：隨機(jī)選取缺血半暗帶區(qū)視野，以CanonD90數(shù)碼相機(jī)用統(tǒng)計(jì)焦距進(jìn)行拍攝，所得圖片用MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)透光度，以平均灰度級(jí)為單位，陽(yáng)性率越高，則染色越深，透光率越低，其平均灰度級(jí)數(shù)值越低。取其算術(shù)平均值用于統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 治療組及對(duì)照組均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體活障礙或?qū)Υ碳o(wú)反應(yīng)等表現(xiàn)，評(píng)分均在2分及以上，其中治療組的神經(jīng)功能評(píng)分低于對(duì)照組（P<0.05）。假手術(shù)組大鼠四肢活動(dòng)能力及抗阻力均正常，對(duì)刺激反應(yīng)良好，無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評(píng)分均為0分。見(jiàn)表1。

2.2 凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù) 治療組及對(duì)照組大鼠的右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)缺血半暗帶中均可見(jiàn)數(shù)量不等的凋亡細(xì)胞，其中治療組凋亡細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組（P<0.05）。假手術(shù)組大鼠無(wú)腦梗死壞死病灶及缺血半暗帶，所有標(biāo)本視野中僅見(jiàn)極少量正常生理狀態(tài)下的凋亡細(xì)胞。見(jiàn)表1、圖1。

2.3 Bcl-2及Bax表達(dá) 假手術(shù)組Bcl-2及Bax表達(dá)極低。治療組及對(duì)照組均可見(jiàn)Bcl-2及Bax表達(dá)，并且該兩組Bcl-2及Bax表達(dá)均低于假手術(shù)組（P<0.05），其中治療組Bcl-2表達(dá)水平高于對(duì)照組，同時(shí)，治療組Bax表達(dá)水平低于對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖2、圖3。

3 討論

目前在我國(guó)，腦血管病已成為導(dǎo)致死亡病因的第一位，糖尿病合并急性腦梗死在中老年患者中亦為常見(jiàn)[5]。在合并糖尿病的腦缺血患者中，血糖的高低與缺血性腦血管病的后預(yù)后密切相關(guān)[6]。細(xì)胞凋亡是腦梗死引起神經(jīng)功能缺損的重要一環(huán)，同時(shí)亦是糖尿病促進(jìn)腦功能損害的其中一個(gè)關(guān)鍵原因[1，7]。Bcl-2和Bax是一對(duì)抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的基因組，二者存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜內(nèi)，在生理及病理狀態(tài)下互相作用，共同參與細(xì)胞凋亡的過(guò)程[8]。Bcl-2和Bax鑲嵌在線粒體膜上，線粒體內(nèi)膜上同時(shí)存在著非特異性通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（PTP）這一結(jié)構(gòu)，在正常生理狀態(tài)下能阻止細(xì)胞色素C（Cyt C）從線粒體進(jìn)入胞漿。Bax是促凋亡基因的代表，能開(kāi)放PTP，使Cyt C進(jìn)入胞漿，與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）的前體結(jié)合活化caspase-9，進(jìn)而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3），引起細(xì)胞凋亡[9]。Bcl-2則是抑制凋亡基因的代表，其作用正好與Bax相反，其能封閉Bax形成PTP的活性，使諸如Cyt C等凋亡因子不能自由通過(guò)線粒體膜，還能通過(guò)阻止caspase活化，中斷caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[10]。實(shí)驗(yàn)研究還表明，Bcl-2和Bax通過(guò)形成同源或異源二聚體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起到調(diào)控作用[11]。Bcl-2/Bax的比值越大，細(xì)胞的存活率越高，反之，則存活率越低。

靜脈溶栓治療及血管內(nèi)取栓治療已成為目前公認(rèn)急性缺血性腦血管病最有效的治療方法[12]，但以上兩種治療方法都有嚴(yán)格的治療時(shí)間窗和禁忌證，致使在臨床上不能廣泛應(yīng)用于大部分于急性缺血性卒中患者。國(guó)家缺血性卒中登記處的一項(xiàng)調(diào)查表明，只有1.6%的急性缺血性卒中患者能夠及時(shí)地接受rt-PA溶栓治療[13]。因此，臨床上急需一類(lèi)沒(méi)有嚴(yán)格時(shí)間窗限制、適應(yīng)證廣、能有效保護(hù)神經(jīng)元，同時(shí)能顯著降低糖尿病患者缺血性卒中后致殘率的藥物。丁苯酞的化學(xué)全稱(chēng)為消旋-3-正丁基苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP），又名芹菜甲素，能通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮、促進(jìn)缺血區(qū)血管新生、改善微血管結(jié)構(gòu)和功能從而增加缺血后腦灌注[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞能促進(jìn)腦缺血再灌注小鼠海馬磷酸化蛋白激酶B及Bcl-2的表達(dá)，通過(guò)抑制缺血半暗帶內(nèi)線粒體釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的活化，下調(diào)c-Jun氨基末端激酶（JNK）和P38的表達(dá)，從而抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴性凋亡通路和非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴性凋亡通路，達(dá)到阻斷凋亡過(guò)程的作用[16-17]。在臨床多中心隨機(jī)雙盲對(duì)照研究顯示，丁苯酞治療組與對(duì)照組相比，患者的肢體活動(dòng)功能、語(yǔ)言功能等神經(jīng)系統(tǒng)功能得到顯著恢復(fù)[18]。同時(shí)，針對(duì)合并2型糖尿病的急性腦梗死患者，丁苯酞可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)、改善患者病后生活能力，經(jīng)《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》推薦用于治療急性腦梗死[19-20]。

在本實(shí)驗(yàn)的糖尿病大鼠中，治療組的神經(jīng)功能評(píng)分及凋亡細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組（P<0.05），治療組Bcl-2表達(dá)水平高于對(duì)照組，Bax表達(dá)水平低于對(duì)照組（P<0.05）。

綜上所述，丁苯酞對(duì)糖尿病合并急性腦梗死患者腦缺血半暗帶中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]房亞蘭，楊楠，趙詠梅，等.大黃酚對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區(qū)HIF-1α與VEGF表達(dá)的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，42（2）：219-224.

[2]陳雯，齊迎春，王玉偉，等.螺內(nèi)酯對(duì)肢體缺血再灌注心肌損傷高遷移率族蛋白B1與Toll樣受體4信號(hào)通路的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2021，23（4）：413-416.

[3]王丹姝，燕柳艷，孫姝嬋，等.葛根素通過(guò)TLR4/Myd88/NF-κB抑制NLRP3炎癥小體抗大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)2021，56（1）：1-17.

[4]譚永麗，唐慧潔，田苑.Nrf2/ARE信號(hào)通路在嗎啡預(yù)處理減輕鹽酸多柔比星誘導(dǎo)心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2021，39（2）：161-168，173.

[5]金蓮錦，胡春陽(yáng)，李罡，等.右美托咪定抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2021，18（9）：29-33.

[6]陳琰琰，張業(yè)昊，徐立，等.通絡(luò)清腦注射粉針對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2021，24（15）：1951-1958.

[7]丁永學(xué)，張昊，孔垂?jié)?，?阿司匹林通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)途經(jīng)減輕缺血再灌注腎損傷[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2021，27（2）：226-229.

[8]方彥玲，許麗萍，連超煒，等.西格列汀對(duì)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞CXCL10及其受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2021，18（2）：22-26.

[9]程岑，顧爾偉.舒芬太尼后處理對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2019，28（7）：603-608.

[10]鄒悅，李金容，唐興江.6-芐氨基嘌呤預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的干預(yù)效果及機(jī)制[J].廣西醫(yī)學(xué)，2019，41（12）：1532-1535，1548.

[11]李金容.缺血后處理對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬區(qū)SOCS-3及TNF-α表達(dá)的影響[D].瀘州：西南醫(yī)科大學(xué)，2019.

[12]何婧.利拉魯肽通過(guò)激活PPARs改善糖尿病大鼠局灶性腦缺血損傷[D].遵義：遵義醫(yī)科大學(xué)，2019.

[13]宋程光，閔鶴鳴，楊鑫，等.原花青素對(duì)2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織半胱氨酸蛋白酶3表達(dá)的影響[J].中國(guó)基層醫(yī)藥，2019，26（6）：693-696.

[14]林冬融，揭育東，韓江全.尤瑞克林對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12表達(dá)的影響[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2019，26（1）：20-24.

[15] Zhang P，Guo Z F，Xu Y M，et al.N-Butylphthalide（NBP）ameliorated cerebral ischemia reperfusion-induced brain injury via HGF-regulated TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Biomed Pharmacother，2016，83：658-666.

[16]岳賽超，郭付有，孫逸杰，等.米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦出血后細(xì)胞凋亡及Dickkopf-1、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2表達(dá)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2019，36（1）：90-93.

[17]林冬融，揭育東，韓江全.尤瑞克林對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后細(xì)胞色素C及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表達(dá)的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，41（4）：424-430.

[18] Wang S，Ma F，Huang L，et al.Dl-3-n-Butylphthalide（NBP）：A Promising Therapeutic Agent for Ischemic Stroke[J].CNS Neurol Disord Drug Targets，2018，17（5）：338-347.

[19] Zhou M，Wang H，Zeng X，et al.Mortality，morbidity，and risk factors in China and its provinces，1990-2017：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J].Lancet，2019，394（10204）：1145-1158.

[20]彭斌，吳波.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018[J].中華神經(jīng)科雜志，2018，51（9）：666-682.

（收稿日期：2021-05-31） （本文編輯：田婧）