新型疫苗佐劑的研究進展

張 榮，李 菁，武永淑，李小明，董金杰，劉學(xué)榮

（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

疫苗接種目前仍然是預(yù)防疫病的主要措施，為有效防控傳染病和畜牧業(yè)的有機發(fā)展提供了有力保障。隨著免疫學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷深入及快速發(fā)展，DNA疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗的研究也邁上了新的臺階，但是這些疫苗普遍存在免疫原性差的問題，因此，需要合適的佐劑來增強其免疫應(yīng)答，提高機體保護力，減少疫苗用量，降低生產(chǎn)成本。傳統(tǒng)佐劑，如鋁鹽佐劑，只能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，不能誘導(dǎo)細胞免疫和細胞毒性T細胞應(yīng)答，質(zhì)量難以控制。為了突破這種限制，對新型疫苗相對應(yīng)的安全有效佐劑的研發(fā)迫在眉睫。新型佐劑種類比較多，無統(tǒng)一的歸類方法。根據(jù)佐劑的作用機制、研究現(xiàn)狀及優(yōu)缺點，將其分為免疫調(diào)節(jié)分子類佐劑、抗原遞送系統(tǒng)類佐劑及前兩種類型佐劑的聯(lián)合類佐劑三種。下面從這三個方面做綜述，為新型佐劑研究提供文獻參考。

1 免疫調(diào)節(jié)分子類佐劑

免疫調(diào)節(jié)分子是由細胞分泌的某些物質(zhì)，該類分子作為佐劑是通過直接作用于免疫系統(tǒng)，刺激相關(guān)免疫細胞的增殖和分化，從而增強抗原特異性免疫應(yīng)答。選擇具有免疫調(diào)節(jié)作用的佐劑將給新型疫苗的發(fā)展提供很大的助力。

1.1 CD40抗體佐劑

CD40是免疫應(yīng)答中重要的共刺激分子，能很好地促進B細胞活化增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過激活CD40信號通路來增強抗原的免疫應(yīng)答。將抗CD40抗體與抗原結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這種結(jié)合可增強與其共軛相連的抗原的免疫原性和記憶性抗體的應(yīng)答反應(yīng)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，CD40抗體可以為B細胞提供CD40信號，增強與其共軛相連的抗原的免疫原性，可作為潛在的佐劑[2]。Ninomiya等[3]發(fā)現(xiàn)CD40抗體可增強記憶性抗體應(yīng)答反應(yīng)，同時還能促進T細胞的增殖，增強T細胞應(yīng)答反應(yīng)并引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。此外，CD40抗體其抗原表達與抗體制備過程相對簡單、毒性小，是一種新型、有潛在價值的免疫佐劑，但目前僅限于實驗室階段。

1.2 CpG-ODNs佐劑

CpG寡脫氧核苷酸（CpG Oligonucleotide，CpG-ODN）是指人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚核苷酸序列，與天然CpG模式識別受體有相似的免疫反應(yīng)，能顯著促進機體的特異性及非特異性免疫應(yīng)答，是一種高效的Thl型疫苗佐劑[4]。作為TLR9的激動劑，CpG-ODN可通過TLR9介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)，直接活化DC和B細胞或間接活化NK細胞和T細胞，將體內(nèi)的免疫環(huán)境向Th1型免疫類型轉(zhuǎn)化[5]。用結(jié)合了CpG-ODN的豬偽狂犬病弱毒疫苗免疫新生仔豬，與單獨接種豬偽狂犬病弱毒疫苗的仔豬相比，血清IgG滴度與粘膜IgA水平均提高了10倍以上[6]。CpG-ODN具有較強的免疫刺激作用和促進Th1型免疫應(yīng)答的特點，能增強多種抗原所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此成為目前被廣泛關(guān)注和研究的一種新型佐劑，但CpG-ODN在體內(nèi)不穩(wěn)定且可誘發(fā)自身免疫性疾病。

1.3 細胞因子佐劑

細胞因子是被抗原刺激后機體細胞產(chǎn)生的小分子可溶性多肽蛋白類物質(zhì)。細胞因子有多種免疫調(diào)節(jié)功能，跟其他佐劑相比具有更獨特的優(yōu)勢，是目前應(yīng)用最廣的一類分子調(diào)節(jié)佐劑。例如白細胞介素（Interleukin，IL）、干擾素（Interferon，IFN）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）及趨化因子（Chemotactic）等。

白細胞介素IL中佐劑效應(yīng)明顯的當(dāng)屬IL-2。Hu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IL-2能有效增強小鼠骨髓細胞的成熟。除IL-2之外，IL-12、IL-21、IL-22也具有一定的佐劑效應(yīng)來增強細胞免疫反應(yīng)[8～10]。干擾素中的IFN-γ可增加抗原遞呈細胞中MHC分子的表達，誘導(dǎo)Th1類應(yīng)答，增強B細胞和NK細胞活性。用含有IFN-γ佐劑的弓形蟲可溶性速殖子抗原（Soluble tachyzoite antigen，STAg）免疫小鼠發(fā)現(xiàn)IFN-γ可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平、長時間的sIgA和IgG抗體免疫應(yīng)答[11]。將含卵清蛋白OVA的殼聚糖水凝膠和GM-CSF聯(lián)合皮下注射小鼠，發(fā)現(xiàn)與對照組相比含GM-CSF的組OVA特異性抗體水平更高，增強了機體的體液和細胞免疫應(yīng)答[12]。將趨化因子作為疫苗佐劑發(fā)現(xiàn)可以增強Th1和Th2型細胞的應(yīng)答，如CCL20、CCL27以及CCL28等。有研究者將CCL27或CCL28作為DNA疫苗的佐劑，肌注小鼠發(fā)現(xiàn)外周IFN-γ和抗原特異性IgG都會升高，從而刺激腸相關(guān)淋巴組織和肺臟特異性T細胞分泌細胞因子，產(chǎn)生中和抗體[13]。

盡管大多數(shù)細胞因子活性易受內(nèi)環(huán)境、水解酶等因素影響且體內(nèi)半衰期較短，但通過對細胞因子的深入研究，這些問題也在不斷得到解決，作為疫苗佐劑細胞因子有很大的潛力。

1.4 皂苷佐劑

皂苷（Saponins）是螺旋甾烷類化合物或三萜的天然糖苷，可激活哺乳動物的免疫系統(tǒng)。天然植物中提取的皂甙與細胞膜上的膽固醇形成復(fù)合物，共同促進T、B淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性MHC-I抗原限制性CTL，刺激分泌多種細胞因子，因此可以作為佐劑使用。

QuilA及衍生物QS-21是具有佐劑活性并應(yīng)用最廣的皂苷類佐劑，可以用來修飾T細胞和抗原呈遞細胞。QuilA既能使外源性抗原刺激機體Th1免疫應(yīng)答，也能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，目前已成為亞單位疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑[14]。Qu等將弓形蟲重組蛋白ROP18與人參皂苷Re聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)添加人參皂苷Re可使ROP18誘導(dǎo)產(chǎn)生更強的體液和細胞免疫反應(yīng)。Brunner等[15]將QS-21包裹于脂質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)可以消除溶血作用并保留其佐劑效果。因此，新型皂苷佐劑的進一步研究對現(xiàn)代疫苗的開發(fā)起至關(guān)重要的作用。

1.5 細菌毒素

細菌毒素中的霍亂毒素（CT）、大腸桿菌不耐熱毒素（LT）、卡介苗（BCG）及脂多糖（LPS）等都可有效促進抗原特異性免疫應(yīng)答[16]。Lycke等發(fā)現(xiàn)，將CT與LT分別與抗原合用口服免疫，可刺激腸道上皮細胞，引發(fā)B細胞生成IgA、T細胞增殖，從而增強免疫反應(yīng)[17]。Iljine等[18]發(fā)現(xiàn)，BCG可以促進GM-CSF分泌、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄及蛋白釋放，增強巨噬細胞無絲分裂早期的活動。單磷酰脂質(zhì)A（MPL）是一種被化學(xué)和遺傳修飾后低毒的細菌性脂多糖，屬于TLR4激動劑，可刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF，MPL和TNF共同促使NK細胞產(chǎn)生IFN-γ，選擇性激活Th1細胞。Lu Y等[19]將低免疫原性的結(jié)核分枝桿菌（Mtb）抗原ESAT-6與MPL/DDA結(jié)合免疫小鼠評價MPL佐劑效應(yīng)，結(jié)果表明添加了MPL佐劑的實驗組可誘導(dǎo)產(chǎn)生更強的Th1應(yīng)答和高滴度IgG1 IgG2b抗體。Kim等[20]用單磷酰脂A和脂質(zhì)體包裹口蹄疫病毒樣顆粒免疫小鼠發(fā)現(xiàn)可以促進對口蹄疫病毒的細胞和體液免疫。MPL作為佐劑已被證明在過敏疫苗、癌癥疫苗和致病菌等一系列疫苗中有效，一般都是跟其他佐劑復(fù)合作用。

2 抗原遞送系統(tǒng)類佐劑

抗原遞送系統(tǒng)類佐劑通過控制物質(zhì)釋放促進對抗原、免疫調(diào)節(jié)分子或兩者聯(lián)合的有效遞送來增強抗原的免疫原性。通過改變抗原或免疫調(diào)節(jié)分子的物理性狀，控制抗原在體內(nèi)的釋放時間及靶向性，提高弱免疫原的有效刺激，增強免疫應(yīng)答。

2.1 脂質(zhì)體（Liposome）

脂質(zhì)體是由非免疫原性和可生物降解的單層磷脂或連續(xù)多層磷脂組成的、能包裹抗原的球體，含有抗原載體和佐劑雙重身份。被脂質(zhì)體包裹的抗原通過與巨噬細胞膜融合后將抗原遞送入細胞質(zhì)內(nèi)，增強巨噬細胞吞噬作用和抗原提呈作用，經(jīng)MHCⅠ類途徑激活CD8+T細胞。將OVA分別與免疫增強劑PAM和CpG-ODN寡核苷酸包裹于脂質(zhì)體中免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)與未包裹脂質(zhì)體的PAM組相比，包裹于脂質(zhì)體的PAM刺激DC細胞成熟能力更強[21]。脂質(zhì)體能靶向免疫細胞，促進抗體交叉表達，作為佐劑雖然具有多功能性和可塑性，但由于在注射部位可能會引起疼痛癥狀，且脂質(zhì)體穩(wěn)定性低、成本高，不宜用于規(guī)模化生產(chǎn)。

2.2 免疫刺激復(fù)合物（Immunostimulating complex，ISCOM）及基質(zhì)

ISCOM是由抗原、磷脂、膽固醇、QuilA組成的、粒徑約40 nm的、具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效力較全面，能延長抗原的存留時間，長期增強特異性抗體應(yīng)答。ISCOM可以使APC攝取疫苗中的抗原，產(chǎn)生滴度高、較持久的抗體以及較強的Th以及CTL免疫應(yīng)答，從而激活機體體液和細胞免疫應(yīng)答。將含前S表位重組乙肝表面抗原和ISCOM佐劑聯(lián)合肌肉注射小鼠，與Al（OH）3對照組相比能產(chǎn)生更高的抗體效價，具有更強的免疫增強作用[22]。ISCOM基質(zhì)（ISCOM-matrix）不含抗原，且無毒副作用可單獨作為良好的候選佐劑。Xiong Q等[23]利用QuilA、磷脂和膽固醇制成ISCOM-matrix作為佐劑與豬支原體肺炎抗原結(jié)合胸腔注射，可導(dǎo)致機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答。ISCOM的加入可以減少抗原使用量，因此可作為亞單位疫苗的有效佐劑使用。

2.3 病毒樣顆粒（Viral-like particles，VLPs）

VLP是一種不含病毒核酸、由一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)自我裝配形成的、粒徑只有20～120 nm的顆粒狀復(fù)合物，具有高度有序的三維結(jié)構(gòu)。VLPs具有較高的安全性和細胞攝取效率，還具有良好的溶解度、生物相容性以及靶向給藥和載藥能力[24]。能夠使疫苗抗原通過多聚化形成大小約100 nm的非可溶性顆粒，被巨噬細胞等APC攝取、處理和提呈，有效誘導(dǎo)體液與細胞免疫應(yīng)答,作為佐劑具有很廣闊的應(yīng)用前景。目前，研究者們已構(gòu)建出多種病毒的VLPs，如口蹄疫VLPs、乙型肝炎病毒表面VLPs等，LIU等[25]經(jīng)過對組裝的嵌合型VLPs進行免疫原性和保護效果的評價，發(fā)現(xiàn)嵌合型VLPs能引起明顯的體液和細胞免疫。GUO等[26]利用原核表達系統(tǒng)制備了VLPs免疫豚鼠、豬和牛，發(fā)現(xiàn)FMDV特異性中和抗體、T淋巴細胞和IFNγ被有效地誘導(dǎo)免疫動物。雖然已有多種病毒的VLPs在實驗室中成功制備，且具有良好的研發(fā)潛力，但要在商業(yè)化應(yīng)用還需要進一步的研究。

2.4 納米顆粒（Nanoparticles，NPs）

NPs是指由粒徑在納米級（低于100/1000 nm）的超微粒子，可有效提高細胞、體液及黏膜免疫，比表面積大。NPs作為遞送類佐劑包括有機和無機納米顆粒兩種。林雅華[27]將磷酸鈣納米顆粒和水痘帶狀皰瘆病毒的糖蛋白E混合，肌肉注射Balb/c小鼠，結(jié)果表明添加了磷酸鈣納米顆粒的組能夠刺激機體產(chǎn)生更高水平的抗體滴度。潘雪[28]將腸道病毒71型病毒樣顆粒（EV71VLP）與乙二醇殼聚糖聯(lián)合注射小鼠，發(fā)現(xiàn)乙二醇殼聚糖佐劑組與單獨注射EV71VLP的實驗組相比，在誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體速度方面具有更好的表現(xiàn)，且抗體滴度顯著升高。Mehrabi等[29]將IL-2的質(zhì)粒DNA包裹于殼聚糖中與副傷寒病毒抗原結(jié)合免疫小鼠，結(jié)果表明殼聚糖包裹的組，機體的細胞免疫和體液免疫水平明顯升高。柴家前等[30]用納米蜂膠顆粒（NPP）免疫初生公雞，結(jié)果表明與對照組相比，機體T淋巴細胞比率和活性均顯著增加。綜上，納米顆粒有助于抗原在細胞內(nèi)加工，與MHC分子特異性結(jié)合、運輸并遞呈給效應(yīng)細胞，增強機體產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答，還能夠通過多種途徑到達APCs調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，具有免疫佐劑活性，但目前仍存在安全性和局部產(chǎn)生不良反應(yīng)等不足，而且不同納米材料的免疫策略及其理化性質(zhì)的不同也成為納米佐劑研究的一大挑戰(zhàn)[31]。

3 復(fù)合系統(tǒng)類佐劑

隨著新型疫苗的快速發(fā)展，單獨使用一種佐劑有時難以誘導(dǎo)理想的免疫反應(yīng)，不能滿足抗疫需要。復(fù)合系統(tǒng)類佐劑指將兩種或兩種以上的佐劑聯(lián)合應(yīng)用，佐劑同時具備免疫調(diào)節(jié)分子和抗原遞送系統(tǒng)的特性與功能，使其在發(fā)揮各自優(yōu)點的同時又互相促進，最大程度地發(fā)揮佐劑效應(yīng)，進一步調(diào)節(jié)或增強免疫應(yīng)答，提高免疫效果。陳振普等[32]將甘氨酸鋅和鋁佐劑復(fù)合與雞血清蛋白抗原聯(lián)合腹部皮下多點注射小鼠，與單獨鋁佐劑的對照組相比，復(fù)合佐劑可以誘導(dǎo)更高水平的抗體應(yīng)答，增強雞血清蛋白誘導(dǎo)小鼠的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。蘇菲等[33]將人參皂苷Rg1和重組大腸桿菌不耐熱腸毒素rLTB聯(lián)合作為佐劑，以卵清白蛋白（OVA）為抗原滴鼻免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)與OVA單獨免疫組相比，Rg1-rLTB能夠顯著上調(diào)Th1、Th2和Th17型細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，提高血清和局部黏膜中的OVA特異性IgA和IgG抗體水平。因此，探究免疫佐劑的生物學(xué)特性及作用機制，有利于合理利用并開發(fā)新型疫苗佐劑。由此可見，多種佐劑復(fù)合發(fā)揮協(xié)同作用在新佐劑開發(fā)中具有相當(dāng)大的潛力。

4 展望

現(xiàn)有佐劑除了明顯的疫苗增效作用外也有不足之處，在未來新型免疫佐劑研制中，研究者應(yīng)同時考慮能夠增強抗原免疫效力、有效激活體液與細胞免疫應(yīng)答、穩(wěn)定性良好、安全性高、便于生產(chǎn)和使用等方面。隨著疫苗佐劑的不斷研究和探索，尤其對于那些免疫原性差、細胞環(huán)境易降解的新型疫苗來說，具有免疫增強和抗原遞送雙重作用的復(fù)合佐劑是將來研究的一大趨勢。因此，全面了解各個佐劑的機制和功能及其對免疫系統(tǒng)的影響，對推動新型高效佐劑的研發(fā)及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用具有重要意義。