Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白1在PHC中的表達(dá)及意義

陳 晟， 簡易成， 周 瑋， 過欣來， 鄭亞新， 熊伍軍

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200120； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院普外科，上海 200120；3. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院肝臟外科，上海 200438)

?

·基礎(chǔ)研究·

陳 晟1， 簡易成1， 周 瑋2， 過欣來2， 鄭亞新3， 熊伍軍1

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200120； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院普外科，上海 200120；3. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽醫(yī)院肝臟外科，上海 200438)

目的 探討Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-1(Wnt induced secreted protein-1， WISP-1)在原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma， PHC)中表達(dá)水平變化及其意義。方法 收集34例PHC患者及12例肝血管瘤患者手術(shù)組織標(biāo)本(包括腫瘤組織及其相應(yīng)的癌旁/瘤旁組織)，用RT-qPCR方法檢測各組WISP-1基因表達(dá)水平，用Western印跡法測定WISP-1蛋白表達(dá)水平，分析WISP-1表達(dá)與PHC患者臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果 WISP-1基因在70.6%(24/34)的PHC患者中高表達(dá)，肝癌組織中WISP-1的平均表達(dá)水平是正常肝組織的(2.65±1.16)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)；Western印跡法測定的蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平一致。WISP-1基因表達(dá)與肝癌的病理分級及腫瘤分期有明顯相關(guān)性，而與年齡、性別、AFP水平、肝癌類型及腫瘤位置無明顯相關(guān)性。結(jié)論 WISP-1在PHC中高表達(dá)，并與其病程進(jìn)展相關(guān)，WISP-1可能是治療PHC的潛在靶點(diǎn)。

Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-1； 原發(fā)性肝腫瘤； 臨床意義

Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-1(Wnt induced secreted protein-1， WISP-1)是Wnt信號通路活化后的下游靶基因之一，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、黏附和遷移，在炎癥、傷口修復(fù)、血管生成及腫瘤生長等病理生理過程中起重要作用[1-2]。WISP-1參與惡性涎腺腫瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管癌(pancreatic ductal adenocarcinoma， PDA)、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，并與其臨床預(yù)后密切相關(guān)。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路活化介導(dǎo)肝纖維化、肝硬化、肝癌的發(fā)生和發(fā)展。但是，有關(guān)WISP-1在肝癌中的表達(dá)水平變化及其意義少有報(bào)道。本研究擬觀察WISP-1在原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma， PHC)中表達(dá)水平變化及其與PHC病程進(jìn)展的相關(guān)性，為尋找治療PHC的潛在分子靶點(diǎn)提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院肝臟外科進(jìn)行手術(shù)治療的34例PHC手術(shù)患者，手術(shù)前均未接受過化療、放療等輔助治療；12例為肝血管瘤患者。PHC患者的年齡為36～80歲，平均(52.6±13.7)歲： 男性28例，女性6例。根據(jù)癌細(xì)胞的分化程度，將肝癌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四級，其中Ⅰ級為高分化型，Ⅱ、Ⅲ級為中分化型，Ⅳ級為低分化型，10例患者病理分級為Ⅰ級，24例患者為Ⅱ-Ⅲ；根據(jù)原發(fā)性肝癌分期標(biāo)準(zhǔn)(中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會2001年修訂)，14例患者腫瘤分期為Ⅰ期，8例患者為Ⅱ期，12例患者為Ⅲ期；24例肝細(xì)胞癌患者，10例肝膽管癌患者；12例患者腫瘤位于肝左側(cè)，18例患者腫瘤位于右側(cè)，4例患者位于肝門部；23例患者血清AFP>400ng/ml，11例<400ng/ml。

1.2 研究設(shè)計(jì)

12例肝血管瘤患者病理學(xué)上確定無肝纖維化或肝硬化，由于肝血管瘤為良性腫瘤，故將其瘤旁組織作為正常肝組織。以上每例手術(shù)患者取肝癌或者肝血管瘤作為實(shí)驗(yàn)組，相鄰的癌旁或者瘤旁組織作為對照組。部分標(biāo)本于液氮保存?zhèn)溆?，剩余組織進(jìn)行RT-qPCR和Western印跡法檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)中的研究標(biāo)本均來自于同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院中心手術(shù)室肝膽外科手術(shù)標(biāo)本，標(biāo)本取材后浸泡于4%多聚甲醛，置于冰上運(yùn)輸。以下RT-qPCR和Western印跡法實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.1 RT-qPCR (1) 引物設(shè)計(jì)。WISP-1上游引物： 5′-ACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAG-3′；下游引物： 5′-TCAGGACACTGGAAGGACACG-3′。GAPDH上游引物： 5′-ACCCAGAAGACTGTGG-ATGG-3′；下游引物： 5′-CAGTGAGCTTCCC-GTTCAG-3′。

(2) 實(shí)驗(yàn)步驟： RNA提取和cDNA的合成： 采用TRIzol試劑提取肝組織總RNA(Invitrogen公司)，行瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下檢測mRNA完整性。取1μg RNA用Oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)： WISP-1和GAPDH的擴(kuò)增片段長度分別為185、171bp。結(jié)果表達(dá)： RT-qPCR結(jié)果以2-ΔΔCt表示，2-ΔΔCt值>1定義為表達(dá)水平上調(diào)。

1.3.2 Western印跡法 用裂解液提取肝組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量。取定量后的蛋白上樣，10% SDS-PAGE(恒壓80V 30min，110V 1h)，并在恒流200mA下120min將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜取出，封閉2h，分別加入人1∶1000稀釋的WISP-1、β-actin抗體，4℃過夜。次日，孵育辣根酶標(biāo)記二抗1h后，采用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織與正常肝組織WISP-1基因表達(dá)水平的差異

WISP-1基因在70.6%(24/34)的PHC患者中高表達(dá)，表達(dá)水平高于正常肝組織1.06～19.56倍，其平均表達(dá)水平是正常肝組織的(2.65±1.16)倍，顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.011)，見圖1。

2.2 肝癌組織與正常肝組織WISP-1蛋白表達(dá)水平的差異

共檢測34例PHC患者癌組織及癌旁組織WISP-1蛋白表達(dá)水平情況。Western印跡法測定表明肝癌組織中WISP-1蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織及正常對照組，WISP-1蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平一致(此處僅展示5例)，見圖2。

圖1 WISP-1在12例肝血管瘤及34例原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)水平變化Fig.1 The expression of WISP-1 mRNA in 12 liver hemangioma and 34 primary hepatic cancer tissues

圖2 WISP-1蛋白在肝臟組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of WISP-1 protein in PHC and matched normal liver tissues

2.3 WISP-1基因水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

WISP-1基因表達(dá)與肝癌的病理分級及腫瘤分期有相關(guān)性，而與年齡、性別、AFP水平、肝癌類型及腫瘤位置無相關(guān)性，見表1。

表1 肝癌組織WISP-1表達(dá)水平與臨床和病理指標(biāo)之間的關(guān)系

注：1為雙側(cè)t檢驗(yàn)；2表示腫瘤Ⅱ和Ⅲ期合并；2-ΔΔCt值>1為陽性，<1為陰性

3 討 論

PHC是我國常見的消化道惡性腫瘤。2015年，PHC在我國所有惡性腫瘤中的發(fā)病率居第4位，而由PHC導(dǎo)致的死亡在所有惡性腫瘤中居第3位[6]，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康，有關(guān)PHC的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)。

20世紀(jì)90年代，Hashimoto等[7]在對大鼠高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性黑色素細(xì)胞突變體進(jìn)行RNA差異篩選時(shí)首次在低轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的表達(dá)基因(expressed in low-metastatic cells， Elm-1)，即WISP-1。WISP-1的生物學(xué)功能使得其與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前，研究[8]顯示，WISP-1在很多腫瘤中呈高表達(dá)，并與多種組織惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后有著密切的聯(lián)系，其中的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究和揭示。WISP-1在惡性涎腺腫瘤的表達(dá)明顯升高，可能是診斷惡性涎腺腫瘤的新的分子標(biāo)記[9]。Tai等[10]的研究表明，WISP-1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，并與結(jié)腸癌臨床分期及預(yù)后相關(guān)。肺癌中也得到類似的結(jié)果，WISP-1在肺癌中高表達(dá)，并與其臨床預(yù)后密切相關(guān)[11]。

目前，有關(guān)WISP-1在肝癌中的表達(dá)水平及其臨床意義的研究較少。本研究通過檢測WISP-1在PHC患者臨床手術(shù)標(biāo)本中表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)PHC癌組織中WISP-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)都顯著高于正常對照組。分析其與PHC病程進(jìn)展的相關(guān)性，結(jié)果顯示W(wǎng)ISP-1的表達(dá)水平與PHC的病理分級和腫瘤分期相關(guān)，而與年齡、性別、AFP水平、肝癌類型及腫瘤位置無明顯關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果與WISP-1在結(jié)腸癌[10]、肺癌[11]等惡性腫瘤中表達(dá)水平變化及與臨床預(yù)后相關(guān)性所觀察到的結(jié)果類似。因此，推測WISP-1在PHC中高表達(dá)并參與PHC的發(fā)生、發(fā)展。

研究[12]顯示，Wnt/β-catenin信號通路的過度激活可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而加速PHC的進(jìn)程。由于WISP-1是Wnt/β-catenin信號通路活化下游的靶基因，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以檢測其上游Wnt/β-catenin信號通路的蛋白marker，例如p-GSK3β/GSK3β， β-catenin等蛋白的變化情況。至于WISP-1下游的分子機(jī)制，目前報(bào)道較多的是其可以作用于整合素信號通路來參與腫瘤的進(jìn)程。例如，在骨肉瘤中，WISP-1通過整合素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移[13]；在前列腺癌中，WISP-1通過αVβ1整合素信號通路促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移[14]。因此，推測在肝癌中，WISP-1可能也作用于整合素信號通路，可以對該通路進(jìn)行檢測。如果結(jié)論得到證實(shí)，則可以利用免疫共沉淀及競爭抑制實(shí)驗(yàn)鑒定與WISP-1結(jié)合的整合素受體，從而進(jìn)一步揭示W(wǎng)ISP-1在肝癌進(jìn)程中的分子機(jī)制。

本研究表明，WISP-1在肝癌組織中過度表達(dá)，WISP-1的表達(dá)水平與肝癌組織的病理分級和腫瘤分期相關(guān)，WISP-1是否可以作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。后續(xù)的研究可以在肝癌細(xì)胞中構(gòu)建WISP-1低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過BrdU/CCK8、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)等，探究WISP-1對肝癌細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡等方面的影響。

[1] Berschneider B， K?nigshoff M. WNT1 inducible signaling pathway protein 1(WISP1)： a novel mediator linking development and disease[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2011，43(3)： 306-309.

[2] Chen CC， Lau LF. Functions and mechanisms of action of CCN matricellular proteins[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009，41(4)： 771-783.

[3] Cheng JH， She HY， Han YP， et al. Wnt antagonism inhibits hepatic stellate cell activation and liver fibrosis [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2008，294(1)： G39-G49.

[4] Monga SP. β-catenin signaling and roles in liver homeostasis， injury， and tumorigenesis[J]. Gastroe-nterology， 2015，148(7)： 1294-1310.

[5] Thompson MD， Monga SP. WNT/beta-catenin signaling in liver health and disease[J]. Hepatology， 2007，45(5)： 1298-1305.

[6] Chen W， Zheng R， Baade PD， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA Cancer J Clin， 2016，66(2)： 115-132.

[7] Hashimoto Y， Shindo-Okada N， Tani M， et al. Identification of genes differentially expressed in association with metastatic potential of K-1735 murine melanoma by messenger RNA differential display[J]. Cancer Res， 1996，56(22)： 5266-5271.

[8] Schneider S， Kloimstein P， Pammer J， et al. New diagnostic markers in salivary gland tumors[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol， 2014，271(7)： 1999-2007.

[9] Chuang JY， Chen PC， Tsao CW， et al. WISP-1 a novel angiogenic regulator of the CCN family promotes oral squamous cell carcinoma angiogenesis through VEGF-A expression[J]. Oncotarget， 2015，6(6)： 4239-4252.

[10] Tai HC， Chang AC， Yu HJ， et al. Osteoblast-derived Wnt-1-induced secreted protein 1 increases VCAM-1 expression and enhances prostate cancer metastasis by down-regulating miR-126[J].Oncotarget， 2014，5(17)： 7589-7598.

[11] Chen PP， Li WJ， Wang Y， et al. Expression of Cyr61， CTGF， and WISP-1 correlates with clinical features of lung cancer[J]. PLoS One， 2007，2(6)： e534.

[12] Takigawa Y， Brown AM. Wnt signaling in liver cancer[J]. Curr Drug Targets， 2008，9(11)： 1013-1024.

[13] Wu CL， Tsai HC， Chen ZW， et al. Ras activation mediates WISP-1-induced increases in cell motility and matrix metalloproteinase expression in human osteosarcoma[J]. Cell Signal， 2013，25(12)： 2812-2822.

[14] Yang JY， Yang MW， Huo YM， et al. High expression of WISP-1 correlates with poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Am J Transl Res， 2015，7(9)： 1621-1628.

Expression of Wnt induced secreted protein-1 in primary
hepatic carcinoma and its clinical significance

CHENSheng1，JIANYi-cheng1，ZHOUWei2，GUOXin-lai2，ZHENGYa-xin3，XIONGWu-jun1

(1. Dept. of Gastroenterology， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200120， China； 2. Dept. of General Surgery，East Hospital， Tongji University， Shanghai 200120， China； 3. Dept. of Hepatic Surgery， Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200438， China)

Objective To investigate the expression of Wnt induced secreted protein-1(WISP-1) in primary hepatic carcinoma(PHC) and its clinical significance. Methods The expression of WISP-1 mRNA and protein in 34 PHC specimens and matched normal liver tissues was detected by quantitative RT-qPCR assay and Western blot， respectively. The correlation between the expression level and clinical features was analyzed. Results WISP-1 gene overexpression was found in 70.6%(24/34) hepatic cancers， and the average expression level of WISP-1 in HCC tissues was 2.65+1.16 times higher than that in normal liver tissues(P=0.011). The WISP-1 protein expression was basically in accordance with mRNA expression. The expression of WISP-1mRNA was correlated with pathologic grade and tumor stage， but no with age， sex， AFP level， histological type and tumor site. Conclusion Our results suggest that WISP-1 might be involved in the development and progression of PHC and may serve as a potential target for therapeutic intervention of PHC.

WISP-1； primary liver cancer； clinical significance

10.16118/j.1008-0392.2016.05.006

2016-06-01

上海市浦東新區(qū)肝臟病專科區(qū)重點(diǎn)?？苹?PWZz2013-05)

陳 晟(1989—)，女，碩士.E-mail： chensheng1116@163.com

熊伍軍.E-mail： xiongwujun@126.com

R 735.7

A

1008-0392(2016)05-0029-05