黃韌帶骨化機制與骨質疏松癥治療策略

常亞南 舒麗 張馳

1.北京大學國際醫(yī)院中心實驗室，北京 102206

2.北京大學國際醫(yī)院骨科，北京 102206

3.北京大學跨學部生物醫(yī)學工程系，北京 102206

骨質疏松癥(osteoporosis)是最常見的代謝性骨病，其特征是骨量減少、骨組織微結構改變、骨強度降低和骨折風險增加[1]。骨質疏松是因為成骨細胞與破骨細胞之間功能不平衡造成的。調控骨形成和吸收關鍵通路機制的發(fā)現(xiàn)，有助確定具有特異作用機制的新治療方法[2]。目前大多數(shù)骨質疏松治療藥物旨在抑制骨吸收，在機制上是針對破骨細胞。由于骨重建過程涉及骨形成和骨吸收，僅使用抗骨吸收類藥物難以有效改善骨量及骨結構，為了更有效治療骨質疏松，刺激新骨形成將是重要策略，在機制上針對的是成骨細胞。目前臨床上還沒有能直接刺激新骨形成的藥物，闡明骨形成過程的基因調控分子機制對指導骨質疏松特異性促骨形成新藥的研發(fā)有重要意義。

骨形成包括膜內成骨與軟骨內成骨兩種方式，膜內成骨是先由間充質細胞分化成為胚性結締組織膜，然后在此膜內成骨，顱面及鎖骨即以此方式形成；軟骨內成骨以預先形成的軟骨為模板然后被骨組織取代的過程為特征，遠較膜內成骨復雜，大多數(shù)骨如四肢、軀干及顱底骨以此方式形成。成骨細胞從間充質干細胞分化而來，經(jīng)歷了由不同轉錄因子及信號蛋白調控的多個階段。Ihh是軟骨內成骨所必需的轉錄因子，不參與膜內成骨，它對間充質細胞分化為成骨細胞必不可缺；轉錄因子Runx2參與軟骨內成骨及膜內成骨調控，表達Runx2的細胞能分化為成骨細胞或軟骨細胞；成骨細胞特異轉錄因子Osterix(Osx)是骨形成及成骨細胞分化的必要轉錄因子[3]，Osx基因缺失小鼠胚胎完全沒有骨形成而軟骨形成不受影響。本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要的Osx下游靶基因，包括VDR、SatB2、VEGF、Dkk1、Sost等，進一步確認了Osx對骨形成的重要作用[4]。Osx直接調控成骨細胞標志基因骨涎蛋白(Bsp)[5]。全基因組關聯(lián)分析研究證實Osx與骨質疏松相關[6]。雖然Osx與骨質疏松癥表型有關，但仍需進一步研究以確定Osx在骨形成作用的分子機制，包括探索Osx上游調節(jié)因子。治療骨質疏松癥迫切需要促骨形成新藥，Osx作為骨分子開關是理想的新靶點。而臨床上的另一種骨病為尋找 Osx上游調節(jié)因子提供了很好的參考，那就是黃韌帶骨化(ossification of the ligamentum flavum，OLF)，由于尚未明確的病理性原因在骨外組織黃韌帶里刺激了新骨的形成。

1 黃韌帶骨化

黃韌帶是脊柱椎管內維持脊柱穩(wěn)定性的一個韌帶組織結構。黃韌帶主要由彈力纖維、膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和細胞基質組成[7]。OLF屬于脊柱韌帶病理性異位骨化性疾病，頸椎、胸椎和腰椎均可發(fā)生，其中最常發(fā)生在胸椎尤其是下胸段部位(T9～T12)[8-10]。OLF的病理學特征屬于軟骨內成骨過程[11]。其組織病理學變化為：彈性纖維變性、降解；膠原纖維大量增生，局部成纖維細胞分化形成軟骨細胞，進而分泌軟骨基質形成軟骨；隨后軟骨發(fā)生鈣化，新生血管長入，局部的間充質細胞分化為成骨細胞，最終分泌骨基質，形成成熟骨組織骨化。

胸椎黃韌帶骨化(thoracic ossification of the ligamentum flavum，TOLF)以胸椎的黃韌帶異位成骨為特征，被認為是胸椎椎管狹窄和脊髓病的主要原因，會導致脊髓、神經(jīng)受壓。在TOLF 早期未壓迫脊髓時無明顯癥狀，而壓迫脊髓后常表現(xiàn)為雙下肢僵硬無力、間歇性跛行、腰背部疼痛或并發(fā)下肢疼痛，其起病隱匿，但一旦出現(xiàn)胸脊髓壓迫運動神經(jīng)導致其功能嚴重損害時，致癱率極高[12]。

2 黃韌帶骨化流行病調查

流行病學調查顯示，OLF發(fā)病具有明顯種族差異、性別差異和家族性傾向。OLF主要發(fā)生于亞洲人群，集中于中、日、韓等國家，而歐美及非洲相對較少[13-15]。種族差異提示OLF可能與某種遺傳因素相關。OLF被視為中老年性疾病[16]，有研究顯示其平均發(fā)病年齡為61歲，男性多于女性。當亞洲人年齡超過65歲后，OLF發(fā)病率可高達至20%，然而對于歐美人群發(fā)病情況則少有報道。在一項對中國南方1 736名志愿者進行的研究中發(fā)現(xiàn)，3.8%的志愿者患有TOLF，但無明顯癥狀[8]；另一組研究對993例因存在胸部癥狀而就診患者的CT結果進行了分析，發(fā)現(xiàn)重建胸椎后有63.9%的患者為沒有明顯椎管狹窄的TOLF[9]。明確何種類型及程度的TOLF會引起脊髓損害是臨床診斷的關鍵和難題。

3 黃韌帶骨化治療現(xiàn)狀

外科手術減壓是目前對于TOLF所引起的胸椎椎管狹窄唯一有效的治療方法，然而多種手術常見并發(fā)癥如脊髓或神經(jīng)根損傷、硬膜外血腫形成、硬脊膜損傷及腦脊液漏、術后脊柱失穩(wěn)甚至后凸畸形等仍然給臨床治療和患者預后造成巨大困難，最嚴重的是術中脊髓損傷或術后血腫導致患者術后截癱。許多患者就診時病情已較重，至今仍無有效的非手術治療方法和早期診斷手段。

4 黃韌帶骨化致病機制

OLF致病機制尚不清楚。據(jù)報道OLF發(fā)生與多種因素相關，如力學因素、遺傳因素、內分泌以及微量元素等，這些因素尚難以明確闡明OLF發(fā)病機制。

4.1 力學因素

研究顯示力學異常在OLF 發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Maigne等[17]對胸椎黃韌帶附著部位的骨化進行了研究，發(fā)現(xiàn)關節(jié)突關節(jié)的旋轉幅度與OLF發(fā)生頻率呈正相關，這表明旋轉應力對OLF起重要的作用。有研究報道了OLF發(fā)生于年輕棒球投手的病例，發(fā)現(xiàn)在患者胸腰椎交界處單邊左側OLF壓迫脊髓，同樣證實了反復局部的旋轉機械應力可能促使OLF。研究發(fā)現(xiàn)胸腰椎后凸畸形的患者OLF的發(fā)生率較高，提示作用于黃韌帶的局部機械應力會促進骨化的發(fā)生發(fā)展。細胞學研究發(fā)現(xiàn)機械應力會促進黃韌帶細胞的成骨進程。Fan等[18]對TOLF細胞進行體外拉伸誘導，發(fā)現(xiàn)Runx2、Osx、ALP的表達增加，提示機械應力可誘導黃韌帶細胞成骨分化從而促進TOLF。研究[19]發(fā)現(xiàn)作用于OLF細胞的周期性拉伸應力可通過β-catenin信號途徑激活其骨化。Kim等[20]研究脊髓von-Mises應力和橫截面積對脊髓壓迫的不同程度和形狀的影響，發(fā)現(xiàn)當脊髓橫截面積減少30%～40%或壓縮4 mm發(fā)生形變時，會出現(xiàn)脊髓癥狀。

雖然關于機械應力的研究相對較多，但仍無法解釋所有病例的致病機制，對于歐美、非洲等地關于機械應力導致OLF的報道較少。脊柱局部應力的異常影響對解釋OLF致病機制有其局限性。

4.2 遺傳易感基因

流行病學研究表明OLF主要發(fā)生在亞洲人群且有些患者具有家族傾向性，這些表明OLF可能與遺傳相關[17]，研究已報道易感基因在OLF中起重要作用[21-22]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)因其在人類基因組中分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性強、富有代表性、易于基因分型和快速自動化分析等特點，已作為易感基因和疾病遺傳因素研究的重要方法[23-24]。

4.2.1Runx2 基因：Runx2是參與成骨細胞分化所必需的關鍵因子。Runx2調節(jié)成骨細胞向成骨分化，促進骨組織形成和重建，同時促進多能干細胞向軟骨細胞分化。有研究發(fā)現(xiàn)Runx2中兩個位點RS1321075和RS12333172在OLF患者和對照組之間有所不同，其中一個單倍型的位點表明與OLF的發(fā)病率增加有關[25]。使用成骨培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)韌帶細胞的研究發(fā)現(xiàn)Runx2表達增強，同時軟骨形成因子如結締組織生長因子和軟骨寡聚基質蛋白以及血管生成素1都顯著升高，加入Runx2 siRNA后這些基因表達均受到抑制，而非骨化對照組細胞沒有這些變化，提示Runx2參與異位骨化[26]。

4.2.2骨形態(tài)發(fā)生蛋白：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是多功能性生長因子，在成骨過程中具有關鍵調控作用[27]，研究表明其參與異位骨化[28]。BMP家族有十多個亞型，其中與OLF相關的基因有BMP-2 、BMP-4等亞型[29]。有研究對OLF黃韌帶的BMPs及其受體BMPRs進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在骨化灶周圍的成熟和不成熟軟骨細胞以及離骨化灶較遠的紡錘體形細胞和圓形細胞中均存在BMPRs，同時發(fā)現(xiàn)BMPRs、BMP-2/-4和成骨蛋白-1/BMP-7的配體均共存于OLF，表明BMPs可能參與促進OLF異位骨化位點的軟骨內成骨，且OLF的骨化活動是持續(xù)存在[30]。有研究在循環(huán)機械應力作用下培養(yǎng)原代韌帶細胞，誘導其成骨，發(fā)現(xiàn)施加機械應力能顯著提高胸椎黃韌帶細胞BMP-2 表達[31]。Moon等[32]發(fā)現(xiàn)經(jīng)腺病毒介導的BMP-2 cDNA基因轉染后的黃韌帶細胞可誘導新生骨形成，促進脊柱融合。Qu等[21]發(fā)現(xiàn)存在于TOLF中BMP-2的兩個突變體，即c.460C>G:p.(R154 G) (Novo 1) 和 c.584 G>T:p.(R195 M) (Novo 2)，功能測定發(fā)現(xiàn)突變BMP-2表達促進成骨標記基因表達和成骨分化，表明遺傳因素參與TOLF，由單核苷酸替換導致的BMP-2表達上調可能是TOLF的一種機制。BMP-4在成骨分化中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)患者中BMP-4的兩個 SNP 位點 RS17563 和 RS2855532帶“T”基因型和等位基因型頻率明顯高于正常人，提示BMP-4 基因與TOLF相關[33]。

4.2.3COL6A1：Ⅵ型膠原是一種存在于細胞外基質并具有細胞因子活性的纖維蛋白，可促進細胞分化、增值、遷移等，是纖維軟骨分化的標志物[34]，也與成骨分化密切相關[35]。Ⅵ型膠原蛋白由 α1、α2 和α3 三條鏈構成，其中編碼α1的COL6A1 基因被認為是日本人群脊柱后縱韌帶骨化(OPLL)的易感基因，而OLF和OPLL在流行病學、病因學和病理學上都相似且共存，因此COL6A1很可能是OLF的潛在易感基因。研究發(fā)現(xiàn)COL6A1啟動子(-572 T)SNP的等位基因頻率在OLF患者與正常人之間表現(xiàn)出顯著差異，此外由啟動子(-572)、內含子33(+20)和內含子32(-29)SNP構成的單倍型的總頻率在OLF患者與對照之間也存在顯著差異，表明COL6A1可能是漢族OLF的易感基因[22]。然而有學者得出相反結論，發(fā)現(xiàn)COL6A1的SNP多態(tài)性位點與OLF無明顯相關，可能與基因座選擇、病例選擇以及研究方法差異有關[25]。

4.2.4HLA-DQA1基因：人類白細胞抗原(HLA)系統(tǒng)是最具有多肽性的抗原系統(tǒng)。有報道HLA單倍型與OLF相關[36]，對比分析發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1*0401同OLF呈正相關，可能與OLF易感性相關，DQA1*0201與OLF則呈負相關，可能與OLF抗性相關，表明在HLA-DQA1位點存在易感和抵抗雙重作用，這可能是影響OLF發(fā)病的因素之一。但該研究樣本量較小，該基因和OLF的相關性有待進一步核實。

4.2.5成纖維細胞生長因子：成纖維細胞生長因子(FGF)及其受體FGFR在骨骼發(fā)育中起重要作用，調控成骨細胞增殖、分化和凋亡，其中FGF2是骨和軟骨分化的重要調節(jié)因子[37]。直接測序法對患者和對照者的FGF2、FGFR1、FGFR2和SNP之間的關系進行了對照研究，結果發(fā)現(xiàn)FGF2的rs 1476217多態(tài)性位點與OLF相關[38]?；蚨鄳B(tài)性SNP與OLF的相關性研究有助于發(fā)現(xiàn)OLF易感基因。但是現(xiàn)在關于OLF易感基因的研究仍然處于探索階段。對于同一基因同一位點的SNP相關性研究分析，不同學者的結果存在一定差異，其原因可能涉及多因素，因此開展大樣本量研究有利于發(fā)現(xiàn)OLF易感基因位點。

4.3 內分泌因素

相關研究發(fā)現(xiàn)內分泌代謝異?？赡芘cOLF有關?；加刑悄虿?、肥胖癥、氟骨癥、鈣磷代謝異常等疾病的患者更易發(fā)生OLF。研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠中TOLF發(fā)生率較高，推測高血糖所致胰島素樣生長因子升高可能與OLF有關[39]。瘦素是一種由脂肪組織分泌并參與體內糖、脂肪、能量代謝的肽類激素，也參與骨骼的形成。研究發(fā)現(xiàn)女性骨化患者體內瘦素受體表達高于對照女性，提示瘦素可能與韌帶骨化的發(fā)病相關[40]。其他學者亦證實瘦素與OLF相關，實驗發(fā)現(xiàn)STAT3、Runx2和類固醇受體共激活因子1是介導瘦素刺激TOLF的影響分子，解釋了患有高瘦素血癥的肥胖人群容易發(fā)生OLF[41]。盡管內分泌代謝異?？赡軙餙LF，但是研究報道較少，缺乏大量病例，仍待進一步研究。

4.4 微量元素

微量元素異?？赡芘cOLF有關。有報道表明骨骼氟含量超標可引起OLF[42]。實驗提示氟化物可能通過刺激退變黃韌帶細胞向成骨細胞分化、成熟，而且在誘導黃韌帶退變基礎上進一步骨化[43]。Wang等[44]對OLF黃韌帶組織中微量元素進行了提取定量分析，發(fā)現(xiàn)Ca、F、Zn、Mn、Mo等含量上升，而Cu含量降低，提示微量元素變化可能參與OLF 。有研究表明基礎代謝元素水平與TOLF相關[43]。這些元素對OLF的影響機制尚不清楚。

4.5 Notch信號通路

Notch 是介導細胞信號轉導的受體蛋白，影響成骨細胞增殖、分化和骨化[45]。研究發(fā)現(xiàn)OLF黃韌帶細胞在成骨分化期間JAG1、Notch2、HES1上調，而Notch2過表達會促進黃韌帶細胞的成骨分化，表明Notch參與OLF，Notch可能通過與Runx2和Osx相互作用影響黃韌帶細胞的成骨分化[46]。

4.6 miRNA

miRNA是一個重要的單鏈非編碼RNA家族，在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-132-3p通過FOXO1、GDF5和SOX6抑制黃韌帶細胞成骨分化[47]。其他研究發(fā)現(xiàn)在黃韌帶細胞成骨分化過程中miR-615-3p表達降低，miR-615-3p可以通過轉錄后抑制成骨調節(jié)因子GDF5和FOXO1達到負調控黃韌帶細胞成骨分化的目的[48]。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-490-3p在胸椎黃韌帶細胞成骨分化過程中表達下調，而miR-490-3p的過表達抑制了成骨分化。該研究揭示miR-490-3p通過靶向FOXO1抑制成骨分化參與胸椎黃韌帶骨化過程[49]。

4.7 新方向機制-炎癥因子

近年來，炎癥過程對新骨形成的影響越來越受到重視。骨折后觀察到一個嚴格控制的炎癥期，它觸發(fā)修復級聯(lián)反應，對骨重建至關重要[50-51]。轉基因動物模型已經(jīng)表明腫瘤壞死因子α(TNF-α)在骨折愈合中的重要作用[52]。這表明腫瘤壞死因子-α參與促進出生后骨折修復，骨骼組織發(fā)育和出生后修復過程受不同機制的高度調控。異位骨化和一些骨形成過多的疾病顯示在炎癥期之前[53]。研究顯示炎癥因子Cox2參與了TNF-α的調控[54]。但炎癥因子對TOLF的影響尚不清楚。

本課題組前期通過使用iTRAQ標記的定量蛋白質組學技術對TOLF黃韌帶中的蛋白質進行了檢測[55]，其中有282種差異表達的蛋白質，功能聚類分析顯示上述蛋白質中有十種與炎癥有關，包括腫瘤壞死因子(TNF)。ELISA驗證患者血清TNF-α含量顯著高于對照組，進一步實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠誘導黃韌帶細胞中Osx的表達，表明它可以促進成骨細胞分化，同時可激活Osx下游的成骨細胞基因OCN和ALP。

TNF主要參與炎癥反應、免疫應答以及抗腫瘤等過程，家族成員主要有 TNF-α、TNF-β和TNSF14等。其中TNF-α是一種由單核巨噬細胞分泌的涉及多種疾病發(fā)病機制的促炎癥細胞因子，對成骨分化有雙重作用[56-57]。為了探索TNF-α對TOLF發(fā)病機制的影響，本課題組進行了深入研究[58]，首先通過蛋白質印記再次證實OLF 黃韌帶中TNF-α 蛋白水平升高，原代細胞經(jīng)TNF-α刺激后G1 / S特異性蛋白cyclin D1和c-Myc上調，同時Bmp2和Osx也表達上調，另外ERK抑制劑消除了TNF-α激活Osx的表達活性，提示TNF-α通過ERK途徑激活Osx，這表明TNF-α可能通過G1 / S特異性蛋白cyclin D1和c-Myc調控細胞增殖并且通過Osx誘導成骨細胞分化來參與TOLF，這是首次發(fā)現(xiàn)TNF-α參與TOLF。

5 小結

盡管對于OLF已有相關報道，但其發(fā)病機制仍處于探索階段。上述所提到的相關因素如機械應力、遺傳易感基因、內分泌及微量元素代謝異常，都暫時無法清楚解釋OLF的發(fā)病機制。由于基因及分子變化往往早于影像學病理表現(xiàn)，如何有效防治TOLF是迄今為止尚未解決的醫(yī)學難題。對TOLF分子機制的深入研究將為探索其病因及早期診斷提供線索。

前期通過蛋白質組學技術得到的差異表達蛋白質譜提示了炎癥因子可能參與TOLF的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過cyclin D1和c-Myc調控細胞增殖，同時通過Osx誘導成骨細胞分化參與TOLF ，揭示了TNF-α在胸椎OLF中的參與及其可能的機制，這表明炎癥成分對TOLF病因的影響。有必要進一步研究以探討不同炎癥因子對OLF和Osx影響及其分子機制，這將使人們在蛋白質水平更全面地認識到OLF 的病理發(fā)病機制。OLF可能是個多因素參與的疾病，綜合考慮各方面因素的參與及其機制將有助于更全面深入地了解OLF的致病機制。另一方面，通過基于RNA測序的基因表達譜的最新研究表明，血管生成素2 (angiopoietin-2)參與TOLF的發(fā)生，該研究也顯示血管生成素2促進了Osx的基因表達，是Osx的上游因子[59]。綜上，開展對于黃韌帶骨化致病機制的研究能夠為尋找 Osx上游調節(jié)因子、進而研發(fā)促骨形成新藥提供新的思路。