中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)對組織器官損害的研究進(jìn)展

余武漢，陳浪，李騰飛，肖國輝，張有成

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普通外科，甘肅蘭州730000）

中性粒細(xì)胞（neutrophil） 是人類免疫系統(tǒng)中最豐富的先天免疫效應(yīng)細(xì)胞，含有廣泛有效的抗菌劑，這些抗菌劑主要儲存在特殊的顆粒中。由于中性粒細(xì)胞庫也能損害宿主組織，因此它的三種主要作用受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)：吞噬、脫顆粒和釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs 是在2004年Brinkmann 等[1]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在12 豆蔻酸-13- 乙酸佛波醇（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA） 的刺激下釋放出的一種以DNA 為骨架,其上附著髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、瓜氨酸化組蛋白3（citrullinated histone 3,CitH3）、絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）等物質(zhì)所形成的具有抗菌功能的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]，能夠捕捉、中和并殺死細(xì)菌[3]、真菌[4]、病毒[5]和寄生蟲[6]等，從而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的防御作用。

然而，除了抗菌功能外，NETs 與臨床疾病密切相關(guān)。一項關(guān)于NETs 在急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）患者的研究[7]顯示，ALF 的肝組織中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的NETs 標(biāo)志物CitH3，并發(fā)現(xiàn)NETs 標(biāo)志物水平與ALF 預(yù)后不良呈正相關(guān)，原因是NETs 通過各種機(jī)制激活止血系統(tǒng)，繼發(fā)性加重缺血性損傷。同樣地，在另一項臨床膿毒癥患者的研究[8]顯示，膿毒癥患者入院時記錄的序貫器官衰竭檢測評分（Sequential Organ Failure Assessment，SOFA） 和急性生理與慢性健康評分（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Score，APACHE）與NETs 的形成呈正相關(guān)，同時也與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素8（interleukin 8，IL-8）等促炎因子呈正相關(guān)。以上兩項臨床研究表明NETs 可促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展，針對NETs 的治療，可改善疾病的預(yù)后。另外，NETs 的主要成分對機(jī)體的損傷是多方面的。在急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）中，肺表面活性物質(zhì)可被NETs的產(chǎn)物（絲氨酸蛋白酶）降解，減少肺部炎癥因子的清除。同時，NE 通過改變上皮細(xì)胞的肌動蛋白骨架增加肺泡上皮的通透性，以多重因素加重ARDS 的進(jìn)展。其他的NETs 組分亦可損傷組織：MPO 可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷組織；組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，引起血栓形成，還通過Toll樣受體2（toll like receptor 2，TLR2）和TLR4 造成組織損傷[9]。

因此，NETs 的過度形成和（或）清除減少可能會促進(jìn)炎癥[10-12]、自身免疫性疾病[2]、血管性疾病[13]、血栓形成和缺血再灌注損傷[14]，并可能促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[15-16]，參與多種病理損傷。因此，減少NETs 形成及其組分釋放對一些病理損傷和炎癥性疾病的控制有一定的幫助，這些措施在動物模型中被證明是有效的，是一種有前途的治療方式[17]。

1 NETs的形成途徑

中性粒細(xì)胞釋放NETs 的主要有兩種方式[18]：非煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶（NADPH oxidases，Noxs） 依賴性形成途徑和Noxs依賴性形成途徑。前一途徑是中性粒細(xì)胞的胞漿中存在大量的肽基精氨酸脫亞胺酶 4（Peptidylarginine deiminase 4，PAD4），該酶與鈣離子結(jié)合后，PAD4 就會移位到中性粒細(xì)胞核，接著PAD4 在細(xì)胞核內(nèi)介導(dǎo)組蛋白過瓜氨酸化形成CitH3，這是形成非Noxs 依賴性NETs 所必需的[19]。后一途徑是運(yùn)用PMA 和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）等激動劑刺激引起NETs 的產(chǎn)生，它們通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)Noxs 依賴的NETs 形成。前者是PMA 刺激后，來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子進(jìn)入胞漿，在胞漿內(nèi)激活蛋白激酶C 的活性，使蛋白激酶C 磷酸化gp91phox/Nox2[20]，促進(jìn)了Noxs 酶的組裝，從而驅(qū)動活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的產(chǎn)生，ROS 隨后分解顆粒和細(xì)胞核的膜[21]，使得NE和MPO 可以自由地與細(xì)胞核相互作用，從而裂解組蛋白，促進(jìn)染色質(zhì)的解縮。這一過程最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞膜完整性的喪失，此時帶有顆粒狀內(nèi)容物的去凝聚DNA 被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，發(fā)揮抗微生物功能[1]。而后者形成的具體機(jī)制尚不清楚，雖然類似于Nox2 磷酸化后的PMA，但這一步驟的上游與PMA 刺激途徑有明顯不同。原因在于LPS 與中性粒細(xì)胞表面的 Toll 樣受體 4（Tolllikereceptor4，TLR4） 結(jié)合，可誘導(dǎo)Noxs 依賴性NETs 的形成，且呈劑量依賴性，而抑制劑TAK242 可消除這一效應(yīng)[22]。此外，c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 抑制劑SP600125 和TCSJNK60 對LPS 誘導(dǎo)的NETs 形成有顯著的干擾作用，但對PMA 無明顯影響，表明這兩種激動劑確實通過兩種不同的機(jī)制發(fā)揮作用

2 NETs對機(jī)體的損傷

NETs 在抵抗急性感染的免疫防御中起重要作用，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的NETs 過多和（或）NETs 清除減少時就會對機(jī)體造成一系列損傷[17,23]。

2.1 NETs與肺部疾病

近年來，囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）[24]、哮喘[25]和輸血相關(guān)急性肺損傷（transfusion-related acute lung injury，TRALI）[26]等多種肺部疾病的潛在發(fā)病機(jī)制都與NETs 的形成有關(guān)。

CF 是一種常染色體隱性遺傳性疾病，由囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR） 基因突變引起[27]。在CF 患者的肺部中存在大量的中性粒細(xì)胞，并且中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡受到抑制，其原因與中性粒細(xì)胞上的CFTR 功能降低有關(guān)，從而使延遲凋亡的中性粒細(xì)胞在CF 患者更有效地形成NETs。大量的NETs 和CFTR 的缺失將誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，造成CF 患者頻繁的肺部感染[24,28]。同時，相關(guān)實驗表明，CF 患者的肺部環(huán)境更能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的生存表型[28]，通過運(yùn)用ivacaftor（CFTR 增強(qiáng)劑） 治療G551D 突變的CF 患者，可以有效逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase） 是特異性靶向DNA 的核酸內(nèi)切酶，主要由DNase1 家族發(fā)揮降解雙鏈和單鏈DNA 的作用[29]。DNase1 常用于CF 治療，主要通過分解NETs 釋放的細(xì)胞外DNA（extracellular DNA，eDNA），降低肺部黏液濃度[30]。實驗研究[31]顯示，運(yùn)用DNase I 治療的患者顯示出良好的治療效果，患者咳嗽次數(shù)、活動水平、食欲和睡眠得到改善。

在哮喘患者的支氣管活檢中檢測到來自中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞釋放的NETs[32]。一項研究[33]顯示，哮喘患者的肺功能損傷程度與痰液中eDNA 成正相關(guān)，同時檢測到在高濃度的eDNA 亞組中表達(dá)更高的NE-DNA 復(fù)合物和CitH3-DNA 復(fù)合物，并且哮喘控制分?jǐn)?shù)相比低濃度eDNA 患者明顯降低，高濃度eDNA 亞組患者的用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC） 更差，表明NETs 形成會加劇哮喘的嚴(yán)重程度[34]。同樣，與低濃度eDNA的患者相比，高濃度eDNA 患者的痰液檢測到更高活性的天冬氨酸蛋白水解酶1（caspase-1）及更高水平的白細(xì)胞介素1β（IL-1β），這兩種物質(zhì)均是炎癥體激活的標(biāo)志物，與增加哮喘氣道炎癥密切相關(guān)[32]，并與以往的一項研究結(jié)果一致[33]。因此，哮喘中的NETs 對呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制起著重要的作用，過量的NETs 積聚通過激活先天免疫反應(yīng)，加重肺部感染。然而，目前對于NETs 引起肺部疾病的確切機(jī)制尚未完全闡明，以及直接針對NETs 的靶向治療是否會給患者提供益處，亦不完全清楚，仍需進(jìn)一步探索。

TRALI 是一種在輸血過程中出現(xiàn)的罕見并發(fā)癥，以急性非心源性肺水腫、低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。組織學(xué)上，TRALI的特征是肺部存在肺水腫和大量中性粒細(xì)胞浸潤[35]。目前關(guān)于TRALI 的發(fā)病機(jī)制理解為二次打擊學(xué)說模型[36]：第一次打擊包括長期酗酒、抽煙、休克、肝手術(shù)、機(jī)械通氣時氣道壓的峰值升高、白細(xì)胞介素10（IL-10）水平降低和全身性炎癥等原因造成。第二次打擊可能由血制品中存在抗白細(xì)胞抗體或其他因素引起，其中在80%是由抗人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA） 的I、II 類抗體或抗粒細(xì)胞特異性抗原（human neutrophil antigen，HNA） 的抗體引起TRALI 的發(fā)生。

在一項體外研究[37]中，運(yùn)用HNA-3a 與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)時檢測到NETs 的產(chǎn)生。進(jìn)一步的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，診斷TRALI 患者血清循環(huán)eDNA、核小體和MPO 水平顯著升高[30]，但引起TRALI 的獻(xiàn)血者中沒有明顯檢測到有關(guān)NETs 及其標(biāo)志物的存在。關(guān)于NETs 在TRALI 的形成，其機(jī)制可能由活化的血小板與中性粒細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生，而NETs 可進(jìn)一步增加單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，加重TRALI 引起的肺水腫[38]。同樣地，Caudrillier等[26]在實驗性TRALI 模型中運(yùn)用阿司匹林或糖蛋白IIb/IIIa 抑制劑抑制血小板活化可減少NETs 形成，改善肺部組織損傷，同時使用組蛋白阻斷抗體和DNase 1 直接作用于NETs 的主要成分后，顯著減輕了NETs 在肺部的沉積，改善小鼠肺部功能及提高機(jī)體血氧水平。另有研究[32]顯示、，在血液儲存期間，血小板釋放的生物活性脂質(zhì)可以激活中性粒細(xì)胞并引起NETs 形成，這是一種非抗體介導(dǎo)TRALI 的發(fā)生。TRALI 是導(dǎo)致患者輸血過程中死亡的原因之一，2018年英國SHOT 報告顯示，在2003—2018年期間，TRALI 的死亡病例數(shù)占確診人數(shù)的17.8%，但是目前臨床上缺乏有效的治療手段[39]。而多項研究[26,37]顯示，DNase 可以破壞NETs 結(jié)構(gòu)，減少肺水腫，可能是TRALI 潛在的治療靶點(diǎn)。然而，NETs 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成是復(fù)雜的，血小板的聚集和活化與NETs 結(jié)構(gòu)也密不可分，因此，需要更多研究進(jìn)一步探究其對TRALI 的治療性效果。但不可否認(rèn)的是，NETs 對TRALI 的發(fā)生具有直接作用。

2.2 NETs與肝臟疾病

NETs 除了參與肺部疾病的損傷外，還參與肝臟損傷，包括肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia and reperfusion injury，HIRI）、膿毒癥相關(guān)肝損傷（sepsis-related liver injury，SRLI） 等。HIRI 是肝移植和肝切除手術(shù)過程中常涉及的共同病理生理變化，由多種因素共同參與，包括無氧代謝、線粒體損傷、氧化應(yīng)激和ROS 的分泌、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、Kupffer 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子等都參與了HIRI 的發(fā)病過程[40]。據(jù)報道[41-43]，NETs 與HIRI 密切相關(guān)。Zhang 等[43]數(shù)據(jù)顯示，HIRI 組小鼠比空白對照組檢測到更高水平的Cit-H3-DNA 復(fù)合物和循環(huán)游離DNA（circulating-free DNA，cfDNA）等NETs 的組分，誘導(dǎo)NETs 形成關(guān)鍵酶PAD4 的mRNA 亦明顯增高，并且NETs 與肝損傷指標(biāo)（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶）成正相關(guān)。在另外一項實驗中，Huang 等[41]運(yùn)用PAD4 的特定抑制劑（YW3-56 或YW4-03） 或DNase I 處理小鼠后，肝竇擴(kuò)張和肝門管區(qū)周圍的肝細(xì)胞壞死明顯減輕，推測減少NETs 可減輕小鼠HIRI 損傷。研究[41,43]認(rèn)為，肝臟恢復(fù)血液供應(yīng)后大量中性粒細(xì)胞被招募、浸潤于肝臟，造成肝細(xì)胞的損傷。而損傷的肝細(xì)胞釋放的HMGB1 和組蛋白等損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）物質(zhì)，通過TLR4-/TLR9-MyD88 信號通路刺激NETs 的形成。同時，NETs 還可以誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞釋放IL-6、TNF- α 和趨化因子配體10（chemokine ligand 10，CXCL-10）等炎癥因子，形成惡性循環(huán)，加重HIRI 的損傷[44]。

膿毒癥是一種全身感染性綜合征，肝臟既是免疫介導(dǎo)病理損傷的目標(biāo)，亦是清除血液中細(xì)菌及細(xì)菌毒素的關(guān)鍵部位[45]。肝臟抵御機(jī)體免受病原體感染是通過中性粒細(xì)胞和Kupffer 細(xì)胞互補(bǔ)作用而發(fā)揮免疫防御功能，其中Kupffer 細(xì)胞通過免疫球蛋白超家族受體（complement receptor of the immunoglobulin superfamily，CRIg）的補(bǔ)體受體捕獲細(xì)菌，而中粒細(xì)胞通過NETs 的形成捕獲循環(huán)病原體，對抵御機(jī)體感染至關(guān)重要[46]。然而，在機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重感染期間，肝臟內(nèi)形成大量的NETs 并超過其他的器官[47]。原因是LPS 刺激內(nèi)皮細(xì)胞上的TLR4 受體可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的CD44 與活化的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）結(jié)合，從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞在肝竇內(nèi)的黏附，并且肝竇上表達(dá)的血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF），將中性粒細(xì)胞釋放的NETs 牢固地錨定在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC），延長NETs在肝竇中的作用[48]。而NE 和組蛋白等NETs 組分具有細(xì)胞毒性特性，可以破壞上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[49]。一項利用活體顯微鏡觀察耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染小鼠的研究[46]發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟內(nèi)的eDNA、組蛋白和NE 等清晰地排列在肝血竇上，并且有局灶性壞死的肝組織附近表現(xiàn)強(qiáng)陽性的組蛋白和NE 染色。該研究進(jìn)一步使用PAD4 缺陷型小鼠研究，發(fā)現(xiàn)肝組織損傷程度因NETs 的抑制而明顯改善，NE 抑制劑西維來司他（sivelestat）也能明顯改善MRSA 感染后的肝損傷，這表明在感染的背景下，NETs 是造成肝臟損傷的重要因素。然而，鑒于NETs 在免疫防御中的關(guān)鍵作用，因此必須權(quán)衡在感染環(huán)境下抑制NETs 形成以減輕肝臟損害的潛在益處和傳播感染的風(fēng)險。

2.3 NETs與腸道疾病

在人類腸道組織中發(fā)現(xiàn)許多種類的細(xì)菌、真菌和寄生蟲已被證明能刺激NETs 的形成。NETs 發(fā)揮抵御細(xì)菌入侵的防御功能是不可否認(rèn)的。然而，激活的中性粒細(xì)胞與類腸細(xì)胞Caco-2 細(xì)胞的共培養(yǎng)模型表明，NETs 可能通過其相關(guān)的蛋白酶與腸上皮細(xì)胞之間的局部直接接觸而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷[50]，表現(xiàn)為人腸上皮樣細(xì)胞的F-actin 細(xì)胞骨架受到破壞，這種破壞可以通過抑制NETs 上的蛋白酶釋放而發(fā)生逆轉(zhuǎn)[50]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌性腸炎模型中，NETs 可以使病原體腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）和產(chǎn)志賀 樣 毒 素 大 腸 桿 菌（shiga toxin-producingescherichiacoli，STEC）通過DNA 鏈附著在腸道黏膜上，從而造成腸道黏膜的損傷[51]。并且大腸桿菌菌株能夠吸收細(xì)胞外的DNA，并將其用作營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)大腸桿菌的生長[52]，使腸道菌群發(fā)生紊亂。在潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）患者的結(jié)腸黏膜中已經(jīng)檢測到了五肽相關(guān)蛋白PTX3、MPO 和NE，它們也是NETs 的成分，雖然這些分子可以獨(dú)立于NETs 分泌，但數(shù)據(jù)支持NETs 參與UC的觀點(diǎn)[53]。而這些NETs 組分參與UC 患者的發(fā)病機(jī)制可能是由于NETs 發(fā)揮促凝活性，增加UC 患者腸道的血栓栓塞事件，加劇UC 進(jìn)展[54]。除此之外，NETs 組分可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[55-56]，減少其在腸道中的局部濃度，可降低NETs 帶來的毒害作用[49]；NETs 還會損害腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致微血管通透性增加，引起組織水腫和氧化損傷。然而，NETs 參與腸道功能損傷的機(jī)制很是復(fù)雜，但相關(guān)研究較少，所以關(guān)于NETs 介導(dǎo)的腸道損傷的詳細(xì)和確切機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

2.4 NETs與腫瘤

最近，一些研究調(diào)查了NETs 在腫瘤中的作用，并報道了它們參與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等過程[15]。研究發(fā)現(xiàn)27 例接受擇期根治性切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectal liver metastasis，CRLM）患者的組織病理學(xué)研究顯示，CRLM 患者的腫瘤組織中有高水平的CitH3 表達(dá)，并顯示CRLM 內(nèi)NETs的存在與患者預(yù)后較差有關(guān)[57]，在彌漫性大細(xì)胞B細(xì)胞淋巴瘤患者中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[58]。此外，PAD4 缺陷型小鼠的皮下腫瘤生長明顯慢于野生型小鼠，同時肝轉(zhuǎn)移模型顯示，PAD4 缺陷型小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移明顯少于野生型小鼠，而且腫瘤負(fù)擔(dān)也更小[57]。其機(jī)制為NETs 增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的線粒體功能，為腫瘤細(xì)胞的加速生長提供額外的能量。具體而言，NETs 釋放的NE 激活腫瘤細(xì)胞表面的TLR4，導(dǎo)致過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α）上調(diào)，增加線粒體的生物合成，從而促進(jìn)腫瘤的生長[57]。以上表明，NETs通過改變腫瘤細(xì)胞的代謝程序，在腫瘤進(jìn)展中起著重要作用。除此之外，NETs 可以包裹循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs），有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[15]。研究[59]顯示，NETs 能夠捕獲CTCs，并繼發(fā)黏附到遠(yuǎn)處的器官上，運(yùn)用DNase 治療時，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在肝竇的黏附減少，表明NETs 在一定程度上可以增加腫瘤的轉(zhuǎn)移。Rayes 等[60]亦表明了NETs 生成缺陷、PAD4-/-及使用DNase1 可以有效減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他組織器官。因此，NETs對腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制NETs 生成可一定程度上阻止癌癥進(jìn)展，在將來可成為有希望的治療措施。

2.5 NETs與其他疾病

促進(jìn)血栓形成NETs 的多種成分也被認(rèn)為是凝血的激活劑，如中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶（neutrophil serine proteases，NSPs）通過降解組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）促進(jìn)凝血，而NE 和組織蛋白酶G 通過蛋白酶激活受體激活血小板[61]；組蛋白H4 刺激血小板釋放無機(jī)多聚磷酸鹽（inorganic polyphoshpate，PolyP） 從而激活FXII 途徑，發(fā)生凝血[62]。McDonald 等[63]證實了NETs 誘導(dǎo)的血管內(nèi)凝血依賴于NETs 中的組蛋白H4、血小板和PolyP 的釋放之間的協(xié)同作用。再者，NETs 內(nèi)的細(xì)胞外組蛋白可以通過接觸途徑組織因子上調(diào)以及間接通過血小板激活以多效性的方式促進(jìn)凝血[64]。Zhou 等[65]表明，NETs 結(jié)構(gòu)易導(dǎo)致腦卒中患者凝血酶和纖維蛋白的形成，從而構(gòu)成動脈粥樣硬化血栓形成的組裝平臺。此外，NETs 相關(guān)蛋白酶和組蛋白可以通過誘導(dǎo)蛋白S（protein S，PS）暴露和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因（tissue factor，TF）來放大內(nèi)皮屏障功能障礙，誘導(dǎo)促凝血劑表型，而DNase I 和/或乳膠黏附素可降低這種促凝血活性，對動脈粥樣硬化血栓形成的治療起到一定的作用。

NETs 與自身免疫性疾病許多研究發(fā)現(xiàn)，NETs被認(rèn)為是自身免疫性疾病中自身抗原的主要來源，特別是那些與抗中性粒細(xì)胞衍生蛋白的自身抗體相關(guān)的疾病[66-67]。研究者[68]在抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關(guān)性小血管炎患者的腎活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)NETs 沉積的證據(jù)，這些患者產(chǎn)生抗MPO 和抗蛋白酶3 等NETs成分的抗體。 類似地，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑膜液中也檢測到NETs 成分[69]。原因是中性粒細(xì)胞自發(fā)或LPS 刺激后形成NETs 促進(jìn)抗瓜氨酸蛋白抗體（anticitrullinated protein antibodies，ACPAs） 的產(chǎn)生，釋放IL-6、IL-8 等免疫刺激分子，加劇自身免疫反應(yīng)。而ACPAs 反過來也可刺激NETs 產(chǎn)生，由此形成一種惡性循環(huán)[70]。NETs 還參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE） 的發(fā)病過程[70-71]。SLE 患者血清中的中性粒細(xì)胞抗菌肽LL-37與雙鏈DNA 所形成的免疫復(fù)合物能作為自身抗原通過B細(xì)胞受體和TLR9 活化B細(xì)胞，產(chǎn)生抗DNA抗體和抗菌肽LL-37 抗體，進(jìn)而有利于核苷酸結(jié)合寡核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體激活，釋放IL-1β 和IL-18，而IL-18 又可促進(jìn)NETs 產(chǎn)生，形成促炎反饋回路，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，SLE 患者存在NETs 的清除障礙，其原因在于SLE 患者體內(nèi)產(chǎn)生抗NETs 抗體，使NETs 免受DNase I 破壞，導(dǎo)致NETs 在體內(nèi)的積累[71]。此外，一些自身免疫刺激誘導(dǎo)的NETs 通過TLR9 和TLR7 信號通路激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，PDC)，從而促進(jìn)α 干擾素（interferon α，IFN-α）的表達(dá)。IFN-α 的大量表達(dá)又可以促進(jìn)單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化，樹突狀細(xì)胞可以呈遞自身抗原給CD4+T 細(xì)胞，導(dǎo)致T 和B 淋巴細(xì)胞的大量增殖，產(chǎn)生自身免疫效應(yīng)[72]。因此，SLE 患者體內(nèi)異常數(shù)量的NETs，不僅是自身抗原的重要來源之一，還可刺激低密度粒細(xì)胞（low-density granulocytes，LDGs）、內(nèi)皮細(xì)胞和PDC等細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，參與狼瘡腎炎等過程，加重SLE 病情的發(fā)展。因此，以作為靶點(diǎn)，控制NETs 的釋放和清除有望成為臨床治療SLE 的方向。

3 針對NETs的治療

到目前為止,通過調(diào)節(jié)NETs 生成主要有兩大方式。分子藥物及針對酶的抑制劑。前者包括抗炎藥（阿司匹林），它選擇性抑制血小板及減少血栓烷A2 信號，抑制NETs 生成[73]。抗血栓藥物（血栓調(diào)節(jié)蛋白）調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的過度激活，從而進(jìn)一步抑制NETs 生成及促凝血反應(yīng)[74]；抗氧化劑（丙酮酸乙酯）通過阻斷ROS 介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）和p38MAPK 活化來減輕NETs 形成和敗血癥引起的腸道損傷[75]。而后者包括各種針對酶的抑制劑，如磷酸二酯酶III，通過增加環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平抑制血小板聚集，以及抑制內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子表達(dá)，減少白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用[76]；Cl-amidine（PAD4 抑制劑） 通過抑制PAD4介導(dǎo)的組蛋白H3 的瓜氨酸化，及降低MMP2 和MMP9 表達(dá)，從而減少NETs 組分的釋放，避免組織器官的損傷[77]。此外，DNase I 對NETs 的降解減少了組織器官的損害[31,60]。

4 小 結(jié)

關(guān)于NETs 的研究仍在不斷地深入，所涉及的疾病也極為廣泛。雖然中性粒細(xì)胞釋放的NETs 對宿主防御發(fā)揮重要的作用，但NETs 參與多種疾病的病理損傷不斷地被研究。在肺部疾病中，NETs可激活先天性免疫反應(yīng)，釋放炎癥激活標(biāo)志物，造成頻繁的肺部感染。通過DNase1 降解NETs 結(jié)構(gòu)，可有效改善肺功能。在肝臟疾病中，NETs 參與HIRI 和SRLI 的發(fā)生。在炎癥因子的作用下，中性粒細(xì)胞對肝臟具有特殊的“親和力”，其與活化的透明質(zhì)酸（HA）結(jié)合，使中性粒細(xì)胞在肝臟聚集黏附，并且肝竇上表達(dá)的VWF 將NETs 牢固地錨定在LSEC，這對NETs 在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用。在腸道疾病中，NETs 可破壞腸上皮細(xì)胞的F-actin 細(xì)胞骨架和促進(jìn)UC 患者的腸道微循環(huán)形成血栓。此外，NETs 還與腫瘤密切相關(guān)，通過改變腫瘤細(xì)胞的代謝水平，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前，針對NETs 及其組分的藥物在動物實驗取得較好的療效，但NETs 組分對機(jī)體的確切作用尚未完全闡明，因此，仍需進(jìn)一步研究NETs 的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為今后臨床相關(guān)疾病的治療方案和特異性靶點(diǎn)藥物的開發(fā)提供新的發(fā)展思路。