二代測序技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

王素梅，張健東，劉樹業(yè) (1.天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300170；2.天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300170；3.衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津 300170)

目前全球感染性疾病現(xiàn)狀嚴(yán)峻，但感染病原體大多仍不明確，病原體的快速測定對臨床醫(yī)師指導(dǎo)臨床用藥非常重要。然而，目前的診斷方法在許多方面都是有限的，如檢測范圍、耗時、特異性和靈敏度。傳統(tǒng)病原檢測方法包括微生物培養(yǎng)、鏡檢、抗原/抗體的免疫學(xué)方法、鑒定、藥敏在感染控制中發(fā)揮著重要作用。檢測病原體特異核酸序列的 PCR方法和基因分型方法等，已經(jīng)無法滿足對病原譜全面檢測的需要。

隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，二代測序亦被稱為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)技術(shù)也逐步成長為主流的測序技術(shù)，該技術(shù)發(fā)展迅猛，通量高、速度快、成本低。NGS 不需要靶特異性引物，在單次序列測定中可確定菌株基因組完整的DNA序列,可用于所有病原體的鑒定和分型。因此，該技術(shù)可在醫(yī)學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室和感染控制中發(fā)揮巨大作用[1-2]。

1 NGS簡介

NGS即高通量測序技術(shù)，在基于序列的基因組研究和新型生物學(xué)應(yīng)用方面逐步推進(jìn)，有望以前所未有的速度對DNA進(jìn)行測序。與傳統(tǒng)的測序方法相比，這些新的非基于Sanger的技術(shù)具有通量高，測序速度快，運(yùn)行成本低和準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢。核心思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成末端的標(biāo)記來確定DNA的序列。其特點(diǎn)是能一次并行幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列測定，且一般讀長較短。在極大降低了測序成本的同時還極大提高了測序效率，是目前病原微生物研究領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的測序手段。NGS無需克隆這一繁瑣的過程，而是將連接通用接頭的基因組DNA 片段進(jìn)行高通量的并行PCR、測序反應(yīng)，所獲得的大量測序數(shù)據(jù)經(jīng)高效能的計算機(jī)生物信息分析技術(shù)分析即可獲得完整的 DNA 序列信息[3]。現(xiàn)有比較成熟的NGS平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system[4]。

1.1Roche/454 FLX：Roche/454 FLX是采用焦磷酸測序原理的測序技術(shù)，T、A、C、G，4 種堿基按順序依次循環(huán)進(jìn)入 PTP(Pico Titer Plate)反應(yīng)板，當(dāng)堿基配對同時釋放一個焦磷酸。在雙磷酸酶，熒光素酶，DNA聚合酶和ATP硫酸化酶的協(xié)同作用下，經(jīng)過相關(guān)反應(yīng)，熒光素被氧化成氧化熒光素，并釋放出光信號，每延伸1個或若干個堿基，就會發(fā)出一次光信號，GS FLX系統(tǒng)將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時測定DNA序列的目的。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于讀取長度大，重復(fù)序列少，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達(dá)400bp，它最主要的一個缺點(diǎn)通量較低，成本相對較高，無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度。適用于從頭測序和宏基因組測序，序列拼裝和獲得新基因。

1.2Illumina/Solexa：Illumina/Solexa測序的核心思想是“邊合成邊測序”(seqencing-by synthesis，SBS)的方法。在堿基延伸過程中形成正確的堿基互補(bǔ)，體系中同時添加改造過的DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP?；蚪M DNA 片段綁定到芯片上(即 Flow cell)，這些 DNA片段經(jīng)過延伸和橋式PCR反應(yīng)后，將每一個DNA片段擴(kuò)大百萬倍，形成一個序列單一的Cluster。每個 Cluster 是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸在堿基延伸過程中對核酸片段進(jìn)行高通量、快速的檢測。Solexa 測序技術(shù)最大的優(yōu)勢在于高通量、低錯誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣，它最主要的缺點(diǎn)是讀長較短給從頭測序拼接帶來困難，適用于RNA 測序和表觀遺傳學(xué)研究。

1.3ABI SOLID 技術(shù)：ABI SOLID測序沒有采用常用的DNA聚合酶，而是 ABI 公司使用的基于磁珠的大規(guī)模并行連接測序平臺，連接反應(yīng)的底物是熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針。其3′端 的1-5 位是隨機(jī)堿基，且 1、2 位構(gòu)成的堿基對可以表征探針的熒光類型，6～8位是能夠隨意配對的人工合成的特殊堿基，5′端為熒光基團(tuán)。連接反應(yīng)中，這些探針與單鏈 DNA 模板鏈配對，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取到堿基排列順序。這樣經(jīng)過 5 輪測序反應(yīng)后便可以得到所有的堿基序列。SOLID測序具有高通量，高準(zhǔn)確度，易區(qū)分 SNP和測序錯誤等優(yōu)勢，原始測序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%，可以說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。它最主要的缺點(diǎn)也是讀長較短給從頭測序拼接帶來困難，使用于高 GC 含量的樣品，基因組重測序和SNP 檢測。

2 NGS在感染性疾病中的應(yīng)用

近年來，全球感染性疾病層出不窮，一方面疑難病原菌不斷增多，另一方面?zhèn)魅静〉膫鞑ニ俣让黠@加快。直接從臨床標(biāo)本中檢測核酸序列為病原菌的監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)提供了新的機(jī)會。分子技術(shù)已成功應(yīng)用于博爾納病病毒、丙型肝炎病毒、辛諾柏病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(人類皰疹病毒8型)、巴爾通體、滋養(yǎng)層皰疹病毒、西尼羅河病毒以及與嚴(yán)重急性冠狀病毒相關(guān)的傳染源的鑒定[5-7]。感染性疾病威脅著人類的健康，因此對感染性疾病的快速診斷提出了更高的要求。NGS技術(shù)在感染性疾病的快速檢測、追蹤溯源中發(fā)揮了越來越重要的作用。

2.1NGS在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的應(yīng)用：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是神經(jīng)科常見疾病之一，常為疑難重癥，神經(jīng)感染性疾病確診的依據(jù)在于從腦實(shí)質(zhì)或腦脊液內(nèi)檢測到病原生物的存在，但受目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測手段的限制，超過一半的腦炎和腦膜炎病例無法明確診斷。目前臨床常用的病原體檢測方法包括腦脊液細(xì)胞學(xué)、病原體特殊染色與形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)菌與真菌培養(yǎng)、病原體核酸檢測等，主要針對特定種類的病原體進(jìn)行有選擇性的檢測，而二代測序技術(shù)則旨在通過宏基因組分析，達(dá)到無偏倚的“全病原體”篩查[8-10]。Wilson MR等報道[11]了一名14歲的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷男孩在為期4個月的時間內(nèi)，三次出現(xiàn)發(fā)燒和頭痛，進(jìn)而發(fā)展為腦積水、癲癇狀態(tài)和昏迷。包括腦活檢在內(nèi)的檢查均未明確其致病病原體。二代腦脊液測序發(fā)現(xiàn)3063784序列中有475個與鉤端螺旋體感染相對應(yīng)(0.016%)。給予針對性的青霉素治療，患者在32天后出院回家。Piantadosi 等報道[12]了一例61歲男子因雙側(cè)頭痛、步態(tài)不穩(wěn)、嗜睡和精神錯亂入院。入院第11天CSF中快速宏基因組測序檢測到Powassan病毒。比標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)測試早4周。結(jié)果顯示了宏基因組測序的極高靈敏度，這對于監(jiān)測新出現(xiàn)和未充分研究的病原體至關(guān)重要。2018年，由北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科關(guān)鴻志教授牽頭的多中心腦炎協(xié)作組，對疑似感染性腦炎而病因未明者行腦脊液NGS，結(jié)果2例檢測出偽狂犬病毒( pseudorabies virus ，PRV )[13]，NGS可以發(fā)現(xiàn)以往未知的病毒性腦炎類型。多個高質(zhì)量的個案報道和臨床研究已經(jīng)表明，NGS 有潛力成為神經(jīng)感染性疾病的診斷工具，有學(xué)者[14]建議將NGS 作為腦炎病原學(xué)診斷的常規(guī)方法開展。

2.2NGS在呼吸道感染性疾病中的應(yīng)用：NGS具有獨(dú)特的潛力，可以克服診斷和檢測方面的挑戰(zhàn)，并且可以顯著提高我們檢測和診斷病原體感染的能力。隨著NGS方法成本的下降，基因組測序和生物信息學(xué)的最新進(jìn)展使得該技術(shù)在常規(guī)診斷環(huán)境中得以應(yīng)用，當(dāng)金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)未能檢測到推定的病原體時，NGS技術(shù)為我們提供了前所未有的機(jī)會。近年來，新發(fā)突發(fā)病原體造成的傳染病疫情給公共衛(wèi)生防控帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)?？焖贉?zhǔn)確識別致病病原對制定疫情防控策略至關(guān)重要。在呼吸道感染中，NGS已用于多種呼吸道標(biāo)本檢測，包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液等，并表現(xiàn)出良好的診斷性能。Fischer 等收集了24個呼吸道樣本(支氣管肺泡灌洗液、痰樣本和拭子)和來自肺炎患者的5個支氣管肺泡灌洗液[15]。與實(shí)時定量PCR檢測流感病毒序列相比，在24個樣本中，有18個樣本中檢測到了流感病毒序列。從8個樣本中可以獲得完整的流感病毒基因組。此外，在24個流感陽性樣本中的3個樣本中，可以檢測到額外的病毒病原體，24個樣本中的2個樣本顯示，已知在流感病毒感染期間引起重疊感染的個體細(xì)菌物種數(shù)量顯著增加。因此，NGS對已知或疑似流感患者的呼吸道樣本的分析提供了與臨床研究相關(guān)的有價值信息。Fisher等報道[16]了德國一名警察由于ARDS被送到急診室，患者接受了機(jī)械通氣，通常引起肺炎的病原體的所有診斷檢測結(jié)果均為陰性，雖然立即啟動抗菌藥物治療，患者在多器官功能衰竭后6天死亡。當(dāng)?shù)诙煲駻RDS被送往同一急診室，醫(yī)生提取支氣管肺泡灌洗(BAL)標(biāo)本中的RNA，50 h 內(nèi)測序檢測出鸚鵡熱衣原體，經(jīng)過11天的抗菌藥物治療后，患者2的情況有所改善，患者被轉(zhuǎn)移到綜合醫(yī)院病房。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測方法，對有效診斷和及時防治感染性疾病具有重要的意義。

2.3NGS在器官移植相關(guān)感染中的應(yīng)用：器官移植是器官衰竭終末患者的重要治療方法，然而用來預(yù)防排斥反應(yīng)的藥物抑制免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致移植受者常常有較高的感染風(fēng)險。NGS能夠確定感染患者的致病病原。Ye 等報道[17]了一名2 歲男孩，為粒細(xì)胞白血病患者在進(jìn)行造血干細(xì)胞移植后，出現(xiàn)黑色皮疹、高熱等癥狀。使用分離培養(yǎng)和 PCR 檢測可疑病原均為陰性，一些常規(guī)的抗菌藥物治療無效，包括萬古霉素、美羅培南、妥布霉素、頭孢吡肟和利福平。在這種情況下，兒科醫(yī)生借助下一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的病原體痤瘡丙酸桿菌，從而指導(dǎo)他們對病原菌使用特定的藥物，患者迅速好轉(zhuǎn)。Palacios 等報道[18]了三名患者在同一天接受了來自同一個捐贈者的內(nèi)臟器官移植，在移植后4至6周死于發(fā)熱性疾病。對各種傳染源的培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和血清學(xué)分析以及寡核苷酸微陣列分析都缺乏信息。高通量測序產(chǎn)生103,632個序列，其中14個符合一種新型沙粒病毒(Arenavirus Burden)。另外的序列分析表明，這種新的沙粒病毒與淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒有關(guān)。 基于獨(dú)特序列的特異性PCR測定證實(shí)了病毒在接受者的腎臟，肝臟，血液和腦脊髓液中的存在。 免疫組織化學(xué)分析顯示接受者的肝臟和腎臟移植物中的沙粒病毒抗原。 在供體血清中檢測到IgM和IgG抗病毒抗體。移植后感染病原的早期診斷會降低移植后感染死亡率。

2.4NGS在血流感染性疾病中的應(yīng)用：早期發(fā)現(xiàn)和鑒定血流感染(BSI)中的病原體對于盡快啟動或調(diào)整抗生素治療非常重要。目前用于診斷BSI感染的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng)，但一般需要一至幾天，NGS直接檢測血液樣本中的病原體，保證了更快的診斷速度。在膿毒血癥診斷中，NGS顯示了獨(dú)特優(yōu)勢，補(bǔ)充了傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法的不足，具有很大的臨床應(yīng)用價值。Long等在北京協(xié)和醫(yī)院ICU 開展的單中心研究納入 78 份膿毒血癥患者血樣[19]。統(tǒng)計細(xì)菌及真菌的檢測結(jié)果，最終有 8 份標(biāo)本培養(yǎng)和測序結(jié)果一致均為陽性，3 份標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果為陽性而測序?yàn)殛幮裕? 份標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果陰性而測序?yàn)殛栃?。以培養(yǎng)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，NGS的靈敏度及特異度分別為72.7% 和 89.6% ；采用血培養(yǎng)聯(lián)合NGS診斷細(xì)菌或真菌感染，陽性率較單用血培養(yǎng)顯著升高(23.08% 和 12.82%，P=0.013) 。此外，通過二代測序還在 14 份血樣中檢測到 15 種病毒，且均通過桑格法測序驗(yàn)證。這表明二代測序聯(lián)合血培養(yǎng)可進(jìn)一步提高病原學(xué)診斷的陽性率。Abril 等報道[20]了一位60歲男性感染性休克和多器官衰竭的病例，該病例是由一種新的全基因組下一代測序分析在24 h內(nèi)診斷出來的，由血漿全基因組NGS診斷和16S rRNA測序證實(shí)為犬Capnocytophaga感染。這項技術(shù)在識別疑難病原體方面顯示出巨大的前景，它對傳染病診斷具有深遠(yuǎn)的意義。體現(xiàn)出宏基因組技術(shù)相對于傳統(tǒng)檢測方法具有更高的效率。

3 總結(jié)與展望

NGS技術(shù)作為一種迅猛發(fā)展的新技術(shù)，突破了傳統(tǒng)檢測方法的局限性。針對難以培養(yǎng)或者原因不明的病原體感染患者，利用NGS可直接對樣本中的病原體 DNA 進(jìn)行檢測，利用已建立的專業(yè)病原體數(shù)據(jù)庫，通過自動化數(shù)據(jù)分析得出準(zhǔn)確可靠的病原體遺傳信息，推動了臨床微生物學(xué)和感染病學(xué)的發(fā)展[21-22]。但是其仍有一些局限性亟待解決：①NGS 工作流程的改善，例如縮短文庫構(gòu)建和驗(yàn)證時間以及數(shù)據(jù)分析自動化等問題還需要進(jìn)一步研究。②用于NGS的參考數(shù)據(jù)庫還不夠完善，大量測序數(shù)據(jù)無法進(jìn)行有效匹配。③尚未開展與常規(guī)檢測方法比對的規(guī)律性研究[23-24]。

綜上所述，二次測序技術(shù)既是病原學(xué)診斷的一次革命，也是病原學(xué)診斷的一個界碑，具有里程碑式的意義。隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，測序技術(shù)在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，在測序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量愈來愈高的要求下，相信基因測序技術(shù)也會持續(xù)的高速發(fā)展[25]。