TSP-1在角膜新生血管生成的作用機制

趙田田，崔 俊，崔仁哲

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院眼一科，吉林 延吉 133000)

無血管狀態(tài)是眼角膜透明度及免疫耐受功能的基礎(chǔ)，而感染、外傷、免疫反應(yīng)等病理條件可導(dǎo)致新生血管形成。在富含血管的環(huán)境中，由于存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，角膜仍然保持著無血管化狀態(tài)。血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)是一種強有力的內(nèi)源性抗血管生成因子和重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可調(diào)節(jié)和影響內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖和運動，與多種新生血管性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，研究發(fā)現(xiàn)TSP-1在維持眼內(nèi)血管平衡中起著重要作用?，F(xiàn)對TSP-1在角膜新生血管中的作用及機制進(jìn)行綜述。

正常情況下角膜透明，沒有血管，周圍的血管從角膜緣斷開。在退化、缺氧、創(chuàng)傷、感染和炎性反應(yīng)等條件下，角膜緣的血管內(nèi)皮細(xì)胞向角膜基質(zhì)內(nèi)生長，形成角膜新生血管(Corneal neovascularization，CNV)。這是一種威脅視力的疾病，每年影響超過140萬人，如果不進(jìn)行治療，便會導(dǎo)致組織瘢痕形成、水腫、持續(xù)性炎癥、星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)沉積，將顯著影響視力預(yù)后和生活質(zhì)量[1]。伴隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，CNV的研究取得了突破性進(jìn)展，目前研究發(fā)現(xiàn)TSP-1在維持眼內(nèi)血管平衡中起著重要作用。探討TSP-1與角膜新生血管形成和發(fā)展的關(guān)系，對預(yù)防和治療角膜新生血管疾病具有重要意義。

1 TSP-1 的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性

Good等人于1990年第一次從人類血小板中成功分離出了一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白TSP-1，并證實了TSP-1抑制血管形成[2]。TSP-1是一個編碼15q15基因的450KD糖蛋白，位于由3條重復(fù)肽鏈的同源三聚體組成，其線性排列中包含6個主要結(jié)構(gòu)域，每一個結(jié)構(gòu)域均負(fù)責(zé)特定功能：①氨基末端是肝素結(jié)合區(qū)域，負(fù)責(zé) TSP-1蛋白的遷移、攝取和細(xì)胞的黏附、趨化；②半胱氨酸區(qū)域與前膠原同源，通過亞單位聚集抑制血管新生；③3個I型重復(fù)序列的區(qū)域，能調(diào)控軸突生長、細(xì)胞間接觸、抑制血管新生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；④3個與表皮生長因子同源的Ⅱ型重復(fù)序列，與可溶性基質(zhì)蛋白相互作用；⑤7個與鈣結(jié)合位點同源的Ⅲ型重復(fù)序列；⑥球形羧基末端參與細(xì)胞黏附、遷移、一氧化氮信號與血小板聚集[3]。其中TSP-1的抗血管生成活性是在前膠原同源區(qū)和I型重復(fù)序列中發(fā)現(xiàn)，TSP-1能與多種含硫酸乙酰肝素糖蛋白、膠原蛋白和纖維連接蛋白的基質(zhì)成分相互作用，它們對基質(zhì)的穩(wěn)定性和重建起著重要作用。TSP-1在巨噬細(xì)胞中介導(dǎo)對凋亡白細(xì)胞的識別和吞噬，參與了炎性反應(yīng)的后期過程，限制了其促炎作用。TSP-1的一個基本和公認(rèn)的特性是通過抑制血管內(nèi)皮生長因子的活性和氣體遞質(zhì)一氧化氮的多效信號來限制內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成。TSP-1的主要細(xì)胞表面受體CD36、CD47和整合素參與重要的細(xì)胞過程，包括凋亡、血管生成、血流、吞噬、遷移和免疫調(diào)節(jié)[4]。

2 角膜新生血管生成的過程與機制

2.1血管生成的過程:血管生成一個嚴(yán)格調(diào)控的過程，原始血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及增殖，產(chǎn)生新的毛細(xì)血管。該過程包括：①內(nèi)皮細(xì)胞的活化和形成血管生成表型；②原始血管基底膜的降解及周圍基質(zhì)的選擇性重塑；③內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、形成管狀結(jié)構(gòu)；④新生血管的形成和新血管的循環(huán)[5]。此過程依賴于一系列血管生成抑制因子和刺激因子之間的相對平衡。一般來說，人體內(nèi)的血管處于靜息狀態(tài)，組織微環(huán)境中的抑制因素占主導(dǎo)地位，因此不會出現(xiàn)新生血管。隨著組織損傷、腫瘤、炎性的發(fā)生，局部微環(huán)境的改變會刺激內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量的新生血管形成因子，從而打破原有組織調(diào)控血管生成的平衡，即血管生成[6]。

2.2CNV的形成機制:①細(xì)胞因子平衡學(xué)說：正常情況下，低濃度的血管生成促進(jìn)因子和高濃度的抗血管生成因子處于復(fù)雜而精細(xì)的平衡狀態(tài)，使角膜透明、無血管化，在病理狀態(tài)下一旦這種平衡被打破，就會產(chǎn)生角膜新生血管。CNV的形成是比較復(fù)雜的病理生理過程，主要表現(xiàn)為：新生血管部位原有毛細(xì)血管的改變、內(nèi)皮細(xì)胞向刺激物的移動、內(nèi)皮細(xì)胞在運動后數(shù)量明顯增加、新的毛細(xì)血管形成、基底膜的形成。但是，目前還不清楚CNV發(fā)生的詳細(xì)機制，可能與以下因素有關(guān)：缺氧、減少抗血管生成因子、增加促血管生成因子、角膜神經(jīng)損傷、角膜水腫、免疫炎性反應(yīng)、角膜緣解剖及功能微環(huán)境改變的異常等。②角膜緣屏障假說：角膜上皮細(xì)胞通過角膜緣不斷更新，角膜基質(zhì)中的膠原蛋白排列整齊、緊密，作為屏障阻止血管的侵入，發(fā)揮物理屏障的作用，阻止導(dǎo)管與結(jié)膜的過度生長[7]。在角膜水腫的狀態(tài)下，致密堆積的板層膠原蛋白被分離，屏障功能受損，角膜緣新生血管無法阻止，于是形成CNV[8]。然而，這一理論不能解釋某些特殊病例如角膜營養(yǎng)不良和內(nèi)皮失代償可引起角膜基質(zhì)水腫但不能引起CNV。所以，破壞角膜緣屏障功能并不是CNV發(fā)生的唯一機制，可能是與其他機制相互作用的結(jié)果。

3 TSP-1抑制血管生成的可能機制

促血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和抗血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的交叉作用可能使TSP-1通過拮抗生存途徑和激活凋亡途徑抑制血管生成，TSP-1通過直接影響內(nèi)皮細(xì)胞的存活和遷移以及間接影響生長因子的動員抑制血管新生。以下是TSP-1抑制血管新生的5種可能作用機制：①抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移：TSP-1能抑制內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)纖維功能蛋白的粘附，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的局部黏附點，間接抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其作用由TSP-1氨基末端的肝素結(jié)合區(qū)介導(dǎo)[9]。TSP-l通過競爭生長因子內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合位點來抑制由生長因子刺激的細(xì)胞增殖，TSP-1還可通過Akt/MAPK途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖，并以CD36的獨立的方式抑制新生血管形成[10]?？笴D36的IgM抗體SM、膠原蛋白和氧化低密度脂蛋白可以模擬TSP-1與CD36結(jié)合，抑制了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；此外，在應(yīng)激過程中TSP-1的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞活力，阻止了細(xì)胞遷移，并通過減少NO的產(chǎn)生而減少了小管形成[11]。②誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡：Nyor等發(fā)現(xiàn)TSP-l介導(dǎo)的血管生成的抑制和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低以及加工激活caspase-3有關(guān)[12]。TSP-1還可通過激活CD36-Fyn-caspase-3-p38MAPK級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和負(fù)向調(diào)控血管生成[13]。③抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)信號：TSP-1已顯示通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體CD36和CD47結(jié)合來拮抗促血管生成NO信號通路，在NO存在的情況下TSP-1是一種100倍的血管生成抑制劑[14]。④基質(zhì)屏障功能：Chan等研究表明，TSP-1在角膜緣形成天然屏障，阻止血管侵入角膜基質(zhì)，在高表達(dá)TSP-1的小鼠中角膜緣產(chǎn)生的新生血管減少[15]。⑤拮抗血管內(nèi)皮生長因子的生物利用度和活性：通過抑制MMP-9的活化，TSP-1可抑制細(xì)胞外基質(zhì)中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的釋放。TSP-1能通過直接與VEGF結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞外液對VEGF的攝取和清除，抑制CNV[13]。另外，TSP-1可阻斷VEGF信號傳導(dǎo)，抑制了VEGFR2的磷酸化，并降低Akt途徑的激活[13]。最新研究證實，在角膜新生血管的形成中TSP-1發(fā)揮著重要的作用。目前，尚需進(jìn)一步研究TSP-1在CNV中的調(diào)節(jié)作用，為尋找治療角膜新生血管的新策略提供指導(dǎo)。Haviv等根據(jù)人TSP-1的第二個I型重復(fù)序列合成了一系列肽，研究發(fā)現(xiàn)ABT-510和ABT-526是第一類模擬TSP-1抗血管生成功能的有效血管生成抑制劑[16]。ABT-510能有效地阻斷小鼠基質(zhì)凝膠塞模型中的新生血管，ABT-526對大鼠角膜新生血管有抑制作用。在兔角膜中TSP-1能抑制成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)引起的血管生成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TSP-1能夠促進(jìn)兔角膜基質(zhì)中的血管生成，并且能夠抑制FGF-2在相同組織中的血管生成。其雙重作用可由不同的結(jié)構(gòu)域引起，其活化血管內(nèi)皮細(xì)胞降解和侵襲的能力也不同[17]。

4 小結(jié)

TSP-1能抑制CNV的形成，為今后角膜新生血管的治療與探索提出新的思路與方向，因為TSP-1分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、數(shù)量少、生物活性多樣等特點，使完整的TSP-1無法直接用于臨床治療。鑒于CNV是由多種病理因素形成的，我們將闡明TSP-1在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及多種細(xì)胞分子之間的相互作用，以探索出更有效的治療方法。但是，如果將其衍生的小肽用于CNV的治療，發(fā)揮誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抗血管生成的作用，將會給CNV治療的研究帶來新的局面。玻璃體腔內(nèi)注射TSP-1模擬肽后，角膜新生血管衰減，小鼠經(jīng)注射TSP-1肽后CNV面積明顯減小。另外，調(diào)節(jié)TSP-1或其抗血管生成模擬肽的表達(dá)可能為CNV的治療提供新的途徑。