濕熱證急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型的建立與評價

★甘斌 李華南 章曉云 吳劍鋒 陳丁鵬 李松

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）是一種由持續(xù)高水平血尿酸誘導(dǎo)關(guān)節(jié)及周圍組織內(nèi)單鈉尿酸鹽（MSU）晶體沉積而觸發(fā)的非感染性自身炎癥性疾?。?］。GA合并癥累及廣泛，如心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖等［2-3］。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示西方發(fā)達(dá)國家在20年間GA發(fā)生率增加了一倍以上，我國GA的發(fā)生率總體也呈上升趨勢，且趨于年輕化［4］。目前國外西醫(yī)治療GA主要采用秋水仙堿、非甾體抗炎藥、皮質(zhì)內(nèi)固醇等對癥治療，這些治療方式短時間內(nèi)便見效但普遍存在胃腸道和腎臟毒性等副作用［5］。中藥用于治療GA歷史悠久，且資源豐富，不但能夠緩解癥狀還可兼顧保護(hù)肝腎功能［6］。現(xiàn)代中醫(yī)傾向于將“證候”與“病”模型相結(jié)合構(gòu)建病證結(jié)合動物模型，同時病證結(jié)合動物模型也是深入研究GA病理生理機(jī)制及評價中藥藥效的重要模式。筆者查閱近年國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn), 對目前較為成熟的濕熱證和GA造模方式進(jìn)行分類敘述, 闡述目前常用的模型評價標(biāo)準(zhǔn), 為篩選穩(wěn)定且具備可重復(fù)性及經(jīng)濟(jì)效益高的病證結(jié)合模型提供科學(xué)依據(jù)。

1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制

1.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對GA的認(rèn)識 GA被冠為疼痛之首，其痛來去如風(fēng)是一種自限性疾?。?］。根據(jù)臨床表現(xiàn)大致分為4個階段：即無癥狀性高尿酸血癥期、急性發(fā)作期、臨界期以及慢性GA和痛風(fēng)石（tophi）期［8］。急性發(fā)作期是GA最主要的臨床表現(xiàn)，炎性急性發(fā)作也是患者就醫(yī)時最迫切需要解決的癥狀，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。急性GA發(fā)作的病理機(jī)制是MSU晶體通過膜受體被先天免疫系統(tǒng)識別為異物，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥趨化因子和活化因子，最終導(dǎo)致大量激活了先天和后天免疫系統(tǒng)［9］。另有研究表明當(dāng)嗜中性粒細(xì)胞在關(guān)節(jié)組織中聚集、浸潤及活化吞噬MSU晶體后，MSU晶體會隨細(xì)胞膜的溶解而釋放，危險信號將持續(xù)存在，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，最終出現(xiàn)急性GA典型癥狀［10-11］。此外急性GA反復(fù)發(fā)作最終導(dǎo)致Tophi的形成并發(fā)展為慢性GA。Tophi是由纖維血管殼和更深層的蛋白質(zhì)電暈組成的有組織的結(jié)構(gòu)，由先天和獲得性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和MSU晶體核組成［12］。隨著Tophi的發(fā)展，尿酸鹽逐漸沉積，引發(fā)關(guān)節(jié)及組織不斷被破壞進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的功能喪失，大大降低患者的生活質(zhì)量。

1.2 中醫(yī)學(xué)對GA的認(rèn)識 古代醫(yī)家對GA的病因病機(jī)和癥狀做出了探討，為后世醫(yī)學(xué)家提供了理論依據(jù)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將GA納入痹證，《素問·痹論篇》明確指出“風(fēng)、寒、濕三氣”為其外因，認(rèn)為風(fēng)寒濕邪滯留經(jīng)脈乃其病機(jī)?！兜は姆ā分兄赋觥氨送达L(fēng)者，大率因血得熱……寒涼外搏，熱血得寒，污濁凝澀，所以作痛”?！兜は姆āね达L(fēng)附肢節(jié)痛》指出“遍身骨節(jié)疼痛，狀如虎咬，或赤腫灼熱，痛有常處，或渾身壯熱”，這與GA急性發(fā)作癥狀非常吻合。

古代醫(yī)家將GA視為“富貴病”“帝王將相病”，現(xiàn)在隨著中國經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們的飲食和生活條件均發(fā)生了結(jié)構(gòu)性的改變，因此GA的患病率逐年上升。94版《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》根據(jù)病因病機(jī)將GA癥型概括為四型：濕熱蘊結(jié)型、瘀熱阻滯型、痰濁阻滯型、肝腎陰虛型，其中濕熱蘊結(jié)型的主癥為患處卒然紅腫熱痛、拒按，觸之灼熱，得熱則劇、得涼則舒，兼癥伴口渴，舌紅，苔黃膩，脈滑數(shù)。國醫(yī)大師朱良春［13］認(rèn)為GA多有飲酒及喜食膏粱厚味的習(xí)慣，其病機(jī)為臟腑升清降濁功能失衡，濕濁瘀滯內(nèi)阻，痰濕阻滯經(jīng)脈而發(fā)病，創(chuàng)立濁瘀痹。鄧運明［14］指出GA病位在中焦脾胃，病機(jī)以脾胃失和為本，濕熱痹阻為標(biāo)，于是提出“固中清消”之法，即固護(hù)中焦，清熱化濕。張有為等［15］研究提示臨床GA中醫(yī)證型主要是濕熱蘊結(jié)證（56.99 %）。謝靜靜等［16］通過對深圳地區(qū)GA患者橫斷面調(diào)查研究GA中醫(yī)證型也是以濕熱蘊結(jié)證為主。劉靖晗等［17］通過2名專業(yè)醫(yī)師對患者一般資料和臨床表現(xiàn)歸納發(fā)現(xiàn)GA患者中醫(yī)證型以濕熱蘊結(jié)證為主且GA部位多發(fā)于第1跖趾關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)。綜上所述GA主要證型為濕熱蘊結(jié)證，基本病機(jī)為飲食不節(jié)和外感風(fēng)寒濕熱等淫邪致使脾失健運，津液代謝失常，聚而為濕，濕熱痰濁瘀阻經(jīng)脈。

2 濕熱證急性GA動物模型的研究現(xiàn)狀

2.1 GA模型 目前國內(nèi)外常用的GA動物模型，主要選用大鼠或兔作為造模動物，制備急性GA或慢性GA動物模型。最直接的方法是模擬臨床患者病理特征直接在模型動物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU晶體。Coderre最早采用該法，將MSU晶體混懸液注入雄性SD大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，進(jìn)而制備急性GA模型，通過觀察大鼠關(guān)節(jié)體征改變和足趾容積測量儀測量前后6 h內(nèi)關(guān)節(jié)體積的變化來判斷是否造模成功［18］。Coderre法具有穩(wěn)定、簡便、易操作等優(yōu)點，但與人類急性GA發(fā)作是由于尿酸鹽濃度達(dá)到一定閾值7.0 mg / dL（420 μmol/ L）時促進(jìn)機(jī)體關(guān)節(jié)內(nèi)MSU晶體的沉積不同，因此不能從本質(zhì)上模擬臨床患者急性GA發(fā)作，僅適用于單一關(guān)節(jié)炎癥狀的研究，用于篩選急性GA抗炎藥物。宋娟等［19］改進(jìn)Coderre法，麻醉后將大鼠一側(cè)踝關(guān)節(jié)固定至90°并常規(guī)消毒，然后用6號針沿跟腱內(nèi)側(cè)與脛骨呈30°～ 40°方向進(jìn)針向踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50 μLMSU晶體混懸液（20 mg/mL），該法從后側(cè)間隙進(jìn)針可避免損傷關(guān)節(jié)軟骨導(dǎo)致創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生進(jìn)而影響實驗結(jié)果。黃火高等［20］改良MSU晶體的制備，并利用改良的Coderre法將50 μL不同梯度濃度MSU晶體混懸液注入Wistar大鼠踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，誘導(dǎo)典型急性GA，結(jié)果表明濃度在5～20 mg/mL×50μL內(nèi)炎癥反應(yīng)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。該法不僅證明誘導(dǎo)急性GA的MSU劑量以20 mg·mL-1×50 μL最佳，也證明改良的MSU晶體制備法形態(tài)與機(jī)體患處沉積的MSU晶體相似提高模型的可復(fù)制性。

2.2 濕熱證模型 盡管目前有較多關(guān)于濕熱證動物模型的報道，但多局限于濕阻證和溫病濕熱模型方面的研究。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為脾胃濕熱證形成的基礎(chǔ)是飲食內(nèi)傷導(dǎo)致脾胃功能失調(diào)所致。吳仕九等［21］對濕熱證的造模進(jìn)行了多方面研究，采用綜合因素高糖高脂+人工氣候箱（溫度35 ℃、相對濕度95 %）+鼠傷寒桿菌造模，成功復(fù)制濕熱證動物模型，并以發(fā)熱、神倦、食量、糞便等指標(biāo)將濕熱證的臨床表現(xiàn)轉(zhuǎn)化為動物辯證可行的四診合參。該法根據(jù)“脾胃內(nèi)傷，濕邪內(nèi)生，外邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”理論，其中肥甘厚膩飲食損及脾胃造成內(nèi)濕后以鼠傷寒桿菌感染為外邪，內(nèi)外引觸而致病，從發(fā)病機(jī)理探討屬于溫病濕熱模型，且與中醫(yī)濕熱證型的主要癥狀和體征大體相似。湯朝暉等［22］以不同致病因素為外邪觀察其溫病濕熱證模型的特征，結(jié)果提示“內(nèi)濕”形成主要在于滋膩厚味飲食內(nèi)傷脾胃導(dǎo)致水液代謝失常濕聚成痰并提出血脂作為濕熱證動物模型的微觀評價指標(biāo)。

3 GA病證結(jié)合模型評價體系的建立

3.1 行為學(xué)評價 辨證論治是祖國醫(yī)學(xué)在臨床診斷中最基本的特征，主要依賴于中醫(yī)望聞問切對采集的癥狀和體征進(jìn)行判別。由于動物和人體的先天差異，其無法通過語言來表述身體變化，這限制了中醫(yī)望聞問切在動物模型評價體系的運用。但我們可加強(qiáng)挖掘動物行為學(xué)的改變從而將臨床中醫(yī)評價體系運用于動物模型。通過觀察動物的精神面貌分析是否倦怠乏力；通過稱量體重、飲食和飲水量分析食欲改變；通過糞便和尿液分析大小便情況；通過測量肛周溫度分析是否發(fā)熱，也可借助舌象分析儀，心電圖等現(xiàn)代化儀器，實現(xiàn)動物行為學(xué)改變到中醫(yī)望聞問切的轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到四診指標(biāo)的客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化［23］。

3.2 微觀病理評價 研究表明，GA的炎癥反應(yīng)與復(fù)雜的細(xì)胞和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，IL-1β、TNF-α等是GA相關(guān)炎性因子［24］。IL-1β在GA急性發(fā)作與消退中起著非常關(guān)鍵的作用，是最經(jīng)典的致炎因子［25］。沉積關(guān)節(jié)的MSU晶體作為急性GA炎癥發(fā)作的啟動因素，通過活化NLRP3炎癥因子/炎癥小體并激活效應(yīng)蛋白胱天冬肽酶-1，進(jìn)而將無任何生物活性的白細(xì)胞介素-1前體（pro-IL-1β）剪切加工為活性IL-1β［26］，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。pro-IL-1β產(chǎn)生的重要途徑是由NF-κB（nuclear factor κB，NF-κB）介導(dǎo)的TLR/核因子κB信號通路［27］。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是維持機(jī)體免疫平衡的重要活性物質(zhì)，具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，既是炎癥反應(yīng)的啟動因子，又是炎癥持續(xù)誘發(fā)因子［28］。臨床急性GA發(fā)作病程中TNF-α發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并且在患者關(guān)節(jié)液、滑膜及血清中均檢測到TNF-α異常表達(dá)［29］。濕熱環(huán)境引起機(jī)體分泌內(nèi)生致熱原TNF-α、IL-1細(xì)胞因子分泌增加，導(dǎo)致體溫升高，從而產(chǎn)生身蜷倦怠、呃逆、大便粘滯不爽等溫病濕熱證樣［30］。研究還發(fā)現(xiàn)濕熱外環(huán)境可上調(diào)TNF-α的基因表達(dá)以介導(dǎo)更多的炎癥因子的產(chǎn)生最終導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)，這可能正是濕熱證形成的一個重要環(huán)節(jié)［31］。IL-1β、TNF-α既是濕熱證的主要致病機(jī)理，也可作為濕熱病證的客觀性微觀評價指標(biāo)。此外對不同中醫(yī)證型的急性GA致炎因子進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：濕熱蘊結(jié)證中IL-1β和TNF-α明顯高于其他證型［32］。

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一類由內(nèi)在膜蛋白組成的高度選擇性跨膜通道。在維持機(jī)體水液代謝的正常生理情況下，AQPs始終保持激活狀態(tài)，通過參與自由水的分泌、吸收介導(dǎo)水的生物膜轉(zhuǎn)運，對保持生物體水恒定及細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起核心作用，是保持機(jī)體水代謝平衡的分子學(xué)基礎(chǔ)［33］。濕熱證“濕”的產(chǎn)生與機(jī)體水液平衡代謝紊亂有著必然聯(lián)系［21］，責(zé)之于各臟腑（主要是肺脾腎）水液疏布功能障礙。其中AQP2是腎臟最常見的AQPs之一，是腎臟集合管水重吸收的核心蛋白，也是目前已知唯一對抗利尿激素（ADH）敏感的水通道蛋白［34］。在濕熱證的微觀病理狀態(tài)下，AQPs的改變，是“濕熱”之“濕”存在于機(jī)體的重要病理機(jī)制之一［35］。

體溫上升是濕熱證的體征之一。血漿內(nèi)皮素（endothelins，ET）是目前已知作用效果最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)而降鈣素基因相關(guān)肽(calcium generelated peptide，CGRP)具有持久、強(qiáng)烈的舒血管作用，可能ET存在生理拮抗，二者相互作用可調(diào)節(jié)全身血管的收縮與擴(kuò)張從而改變循環(huán)系統(tǒng)中血流量變化并影響機(jī)體散熱系統(tǒng)進(jìn)而控制機(jī)體體溫變化［36-37］。研究發(fā)現(xiàn)濕熱證模型血漿ET含量高于空白對照組而CGRP含量則下降，這證實了濕熱證的體溫升高，其“熱”的生理機(jī)制、量化評定與ET-CGRP反饋調(diào)控密切相關(guān)。

4 小結(jié)與展望

西醫(yī)學(xué)特征是辨病，中醫(yī)學(xué)特征是辨證論治，過去單純的“病”或“證”動物模型在中醫(yī)臨床與基礎(chǔ)研究的對接過程中無法很好銜接，因此諸多研究轉(zhuǎn)為將西醫(yī)疾病觀和中醫(yī)基礎(chǔ)理論相結(jié)合構(gòu)建二者均具備的病證結(jié)合動物模型，目的使中醫(yī)臨床與基礎(chǔ)研究相銜接。從中醫(yī)基本理論出發(fā)將“證”和臨床“病”特征相結(jié)合模擬濕熱證急性GA發(fā)病環(huán)境、因素構(gòu)建病癥結(jié)合動物模型，同時探索病證結(jié)合動物模型評價體系，提出把動物行為學(xué)的改變結(jié)合微觀生化指標(biāo)檢測轉(zhuǎn)化為中醫(yī)臨床的望聞問切，從而將四診合參運用于動物模型評價，將IL-1和TNF-α炎性因子用于炎癥反應(yīng)程度評價，AQPs、CGRP和ET作為濕熱證的評價指標(biāo)。