自噬相關(guān)調(diào)控信號(hào)通路在骨重塑中的作用及中醫(yī)藥防治進(jìn)展

莫亞峰 胡敏利 湯樣華 李國松 辛大偉 熊振飛

1.浙江省杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院骨科，浙江杭州 311201；2.浙江省蕭山醫(yī)院醫(yī)共體總院北干分院，浙江杭州 311202

骨不連是骨折后常見的并發(fā)癥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，骨不連的發(fā)生率為1.9%～20.0%，具體取決于骨折部位[1]。例如髓內(nèi)釘固定后股骨干骨不連發(fā)生率為8.0%，髓內(nèi)釘固定后脛骨干不愈合的發(fā)生率為4.6%，而且局部軟組織損傷也會(huì)影響愈合能力[2-3]。骨不連延長(zhǎng)了疾病的治療周期，耽誤了患者早期的康復(fù)，也造成了不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國人口基數(shù)龐大，人口老齡化嚴(yán)重，加之近年來隨著工業(yè)和交通業(yè)的發(fā)展，骨折發(fā)生率呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，對(duì)于骨折患者，防治骨不連的工作刻不容緩。自噬作為人體的自我保護(hù)機(jī)制，能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的更新，保持一定的自噬水平可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的更新，加速骨重塑，而信號(hào)通路作為一種信息傳遞過程可有效激活自噬。目前影響骨重塑的因素及促進(jìn)骨重塑相關(guān)藥物的研究機(jī)制尚未完全明確，中醫(yī)藥或可成為一種新型的自噬誘導(dǎo)劑來防治骨不連，本文現(xiàn)將調(diào)控自噬的相關(guān)信號(hào)通路在骨重塑中的作用機(jī)制及中醫(yī)藥防治進(jìn)行綜述?，F(xiàn)總結(jié)如下：

1 自噬對(duì)骨重塑的作用機(jī)制

成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞三者之間的協(xié)調(diào)是骨重塑的關(guān)鍵因素。成骨細(xì)胞前體在骨表面分化為成骨細(xì)胞，主導(dǎo)骨的形成。破骨細(xì)胞則具有特殊的骨質(zhì)吸收作用，主導(dǎo)骨吸收。有研究表明[4]，在骨折部位修復(fù)重塑過程中，自噬扮演著重要的角色，因此激活成骨細(xì)胞自噬對(duì)骨重塑大有裨益。骨質(zhì)疏松是骨折發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，對(duì)骨重塑影響頗大，保持成骨細(xì)胞適當(dāng)?shù)淖允?，有利于骨的形成，預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生。自噬是真核細(xì)胞獨(dú)有的一種生物降解方式，其主要作用是將異常蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器等進(jìn)行降解和再循環(huán)，以此合成新物質(zhì)的原料，提供給機(jī)體[5]。骨不連的發(fā)生，與成骨細(xì)胞自噬水平較低存在一定聯(lián)系，適度誘導(dǎo)自噬可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖更新，進(jìn)而促進(jìn)骨重塑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[4]發(fā)現(xiàn)，大鼠成骨細(xì)胞缺乏自噬的表現(xiàn)為骨形成、骨吸收及骨轉(zhuǎn)換減少，細(xì)胞自噬水平降低加速了骨組織的氧化應(yīng)激，從而影響骨重塑。自噬還具有雙向協(xié)調(diào)性，一方面可以保護(hù)細(xì)胞，為細(xì)胞提供生存所需物質(zhì)，另一方面也可以通過降解胞內(nèi)大分子從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。因此，調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)促進(jìn)骨重塑將具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。

2 自噬相關(guān)信號(hào)通路對(duì)骨重塑過程的調(diào)節(jié)機(jī)制

2.1 磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt 激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路PI3K 在自噬相關(guān)前體形成時(shí)起著重要的調(diào)控作用。Akt 激酶是結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合癥（tuberous sclerosis complex，TSC）抑制蛋白，而TSC 基因?yàn)閙TOR 的負(fù)調(diào)控因子[7]。mTOR 復(fù)合物（mTOR complex，mTORC）是一種由mTOR 與其他分子組合形成的復(fù)合物，可接受并整合多種信號(hào)，進(jìn)行蛋白質(zhì)或脂質(zhì)合成，從而調(diào)控自噬。朱俊瑾等[8]研究發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，mTOR可作為自噬體形成的啟動(dòng)子介導(dǎo)自噬。殷照陽等[9]通過抑制mTOR 來減弱其對(duì)下游蛋白的調(diào)控作用，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，其研究表明雷帕霉素可有效抑制mTOR通路，激活骨折區(qū)域細(xì)胞自噬，同時(shí)與自噬密切相關(guān)的蛋白含量明顯升高，凋亡蛋白的表達(dá)也被抑制，在多重作用下骨重塑能力顯著增強(qiáng)。骨折受傷部位常因供血破壞而失去營(yíng)養(yǎng)支持，處于營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的細(xì)胞自噬功能被激活，使骨折部位快速過渡血腫機(jī)化期，進(jìn)入骨重塑期。在骨重塑期，膜內(nèi)化骨的完成具有重大意義，在該過程中保持成骨細(xì)胞一定的自噬水平，可預(yù)防骨不連的發(fā)生。

2.2 雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）-沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1（Sirtuin1，Sirt1）信號(hào)通路

在AMPK 及Sirt1 的共同調(diào)控下，ERα 與配體結(jié)合形成的復(fù)合體對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的功能有一定的影響[10]。研究表明[10]，ERα 通過增加LKB1 的活性可激活A(yù)MPK，而AMPK 又是Sirt1 的激活因子，同時(shí)Sirt1 又通過對(duì)LKB1 的去乙?；揎梺硖岣逜MPK的表達(dá)水平，兩者相互促進(jìn)可進(jìn)一步增強(qiáng)成骨細(xì)胞自噬的表達(dá)。另一方面，AMPK 在骨重塑過程中十分關(guān)鍵。AMPK 可抑制mTORC，從而引發(fā)細(xì)胞自噬[11]。AMPK 也可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）向成骨細(xì)胞分化[12]。在骨重塑期，維持充足的成骨細(xì)胞對(duì)骨的修復(fù)具有重要作用，該通路通過促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬、分化來防治骨不連的發(fā)生，對(duì)于保證骨塑形過程的完成意義非凡。

2.3 核因子κB（nuclear factor，NF-κB）信號(hào)通路

NF-κB 是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種信息傳遞因子，激活后可進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[13]。當(dāng)某些因素（如炎癥因子、致癌基因等）刺激細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB 會(huì)被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，進(jìn)而參與細(xì)胞的自噬、凋亡等[14]。Chang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 通路可調(diào)控細(xì)胞自噬，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、礦化。研究表明[15]，NF-κB 信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞自噬為負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制該通路介導(dǎo)的反應(yīng)可有效防止骨量流失，從而加速骨重塑。當(dāng)骨折發(fā)生時(shí)，成骨細(xì)胞被外界因素刺激，NF-κB 轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，控制自噬的基因被啟動(dòng)，成骨細(xì)胞自噬被激活，從而加速骨的重塑。

2.4 核因子受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）/核因子受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）/骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）信號(hào)通路

由成骨細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的RANKL 與破骨細(xì)胞表達(dá)的RANK 二者結(jié)合形成的信號(hào)分子被破骨細(xì)胞前體所接收，促進(jìn)前體向破骨細(xì)胞分化，但該信號(hào)分子活性調(diào)控取決于成骨細(xì)胞[16]。由于OPG 擁有遠(yuǎn)強(qiáng)于RANKL 的RANK 親和性，因此在兩者的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)中，RANKL 與RANK 的結(jié)合就相對(duì)處于劣勢(shì)，因此引起破骨細(xì)胞分化、自噬等反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)過程被極大地抑制，故其在破骨細(xì)胞增殖過程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用[17]。OPG 通過Akt 激酶/mTOR/ULK1 信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬來抑制破骨細(xì)胞骨吸收[18]。骨髓基質(zhì)及成骨細(xì)胞分泌OPG，保持OPG/RANK 的平衡狀態(tài)，可防止過度的骨吸收，維持骨代謝的平衡[19]。在骨質(zhì)重塑過程中，抑制骨吸收與促進(jìn)骨形成同等重要，兩者的相對(duì)平衡才能促進(jìn)骨的迅速修復(fù)。

2.5 其他信號(hào)通路

影響骨重塑的相關(guān)信號(hào)通路還存在如Hedgehog信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等，但是其是否能通過調(diào)控自噬來促進(jìn)骨重塑目前尚不明確。

3 中醫(yī)藥的干預(yù)作用

在中醫(yī)陰陽理論認(rèn)為，骨不連是處于陰陽失和的階段，因此通過調(diào)和陰陽來調(diào)控自噬水平，被認(rèn)為是治療骨不連的新思路[20]。中醫(yī)常用來促進(jìn)骨重塑的補(bǔ)腎法就是使機(jī)體達(dá)到陰陽平和的有效手段之一。文獻(xiàn)報(bào)道[21]，補(bǔ)腎類中藥及其活性成分可顯著促進(jìn)BMSC的增殖，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)激活自噬機(jī)制，促進(jìn)骨重塑。在骨折重塑過程中，氣血瘀滯也被認(rèn)為是重要的病機(jī)。研究表明[22]，活血行氣類中藥促進(jìn)骨重塑的作用與激活自噬的某些信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)。目前能服務(wù)于臨床的自噬通路誘導(dǎo)劑有限，因此中醫(yī)藥調(diào)節(jié)自噬的作用為臨床通過藥物促進(jìn)骨重塑提供了新的思路。

3.1 中藥提取物

隨著現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)和研究方法的進(jìn)步，中藥提取物已被廣泛研究和應(yīng)用。近些年有大量關(guān)于中藥提取物通過某些信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)研究，如Liu 等[23]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在雷帕霉素和PI3K/Akt 激酶抑制劑LY294002 的共同培養(yǎng)下，姜黃素可通過抑制PI3K/Akt激酶/mTOR 途徑誘導(dǎo)凋亡和自噬。Yeh 等[24]研究表明姜黃素調(diào)控RANKL/RANK/OPG 通路維持成骨細(xì)胞活性，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞活性。姜黃提取物等可抑制NF-κB 通路的激活[25]。丹參酮通過使PI3K/Akt 激酶/mTOR 信號(hào)途徑失活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[26]。另外，研究發(fā)現(xiàn)[22]，活血行氣類中藥不僅可以有效調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG 信號(hào)通路的紊亂，而且可以通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL 的比值使破骨細(xì)胞的生成被有效抑制，同時(shí)還可以改善局部血流，為骨小梁的修復(fù)提供所需的營(yíng)養(yǎng)，從而進(jìn)一步促進(jìn)骨重塑。以上研究表明，中藥提取物可抑制或激活大量信號(hào)通路，而這些通路在骨重塑中具有顯著作用，因此使用中藥提取物可用于防治骨不連。

3.2 中醫(yī)復(fù)方

中醫(yī)復(fù)方是在中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，通過辨證論治確定治則治法后，按照組方原則選取合適藥物，確定劑量，妥善配伍后組成的方劑。四妙勇安湯已經(jīng)被證明可激活過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路來影響自噬[27]，并且研究還發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路對(duì)自噬和成骨細(xì)胞均有著不同程度的影響[28]。田濤等[29]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，二至丸（墨旱蓮，女貞子）可通過上調(diào)成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)，增加機(jī)體骨量，促進(jìn)骨重塑；亦可通過下調(diào)破骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)，抑制骨吸收。該研究通過建立動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型驗(yàn)證了二至丸抗骨質(zhì)流失作用的優(yōu)越性，提示二至丸可通過降低自噬相關(guān)基因表達(dá)水平從而抑制破骨細(xì)胞的分化，但相關(guān)通路調(diào)節(jié)尚不明確。劉鋅等[30]證實(shí)右歸飲具有調(diào)節(jié)BMSC 自噬的作用，并促使其成骨化，但尚不能確定右歸飲的自噬調(diào)控作用與細(xì)胞結(jié)局之間是否具有因果關(guān)系。因復(fù)方成分復(fù)雜、藥理作用多樣、作用廣泛，故研究難度較大。但是復(fù)方的療效卻是不容置疑的，其在縮短骨折病程、促進(jìn)骨重塑方面療效顯著。

3.3 中醫(yī)外治法

中醫(yī)外治法包括膏藥敷貼、針灸、按摩、熏洗等。在骨重塑方面，臨床多采用活血類中藥材制成膏藥外敷或中藥液熏洗。但目前關(guān)于中醫(yī)外治法通過調(diào)控自噬來促進(jìn)骨重塑的研究較少，其具體機(jī)制也尚不清晰。

4 小結(jié)與展望

自噬在骨重塑過程中的作用已經(jīng)獲得研究證實(shí)，但對(duì)其具體作用和相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)尚存在分歧，對(duì)調(diào)控自噬的相關(guān)信號(hào)通路尚有待進(jìn)一步研究。中醫(yī)藥現(xiàn)階段雖然在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬方面已取得了一定的成果，但對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的具體中藥有效成分及合適劑量仍待明確，中藥復(fù)方和中藥外治是否能通過調(diào)控細(xì)胞自噬促進(jìn)骨重塑，也尚有待進(jìn)一步的探究。未來，需深入研究如何把控自噬的雙向協(xié)調(diào)能力，使其傾向于對(duì)機(jī)體有利的一面，同時(shí)充分發(fā)揮中醫(yī)藥在骨重塑治療中的重要作用，為骨不連的治療開辟新的思路和方法。