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    秸稈還田對半干旱區(qū)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

    2021-03-27 01:22:50孫孟琪劉浩然劉小丹王洪君欒天浩王立春陳寶玉
    關(guān)鍵詞:脲酶耕作群落

    孫孟琪,劉浩然,劉小丹,王洪君,王 楠,高 陽,欒天浩,王立春,陳寶玉

    (1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室,吉林 長春 130033;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,吉林 長春 130118;3.白城市農(nóng)業(yè)機(jī)械化技術(shù)推廣站,吉林 白城 137000)

    土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在土壤有機(jī)質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1].同時,土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質(zhì)量和肥力的一個關(guān)鍵性指標(biāo)[2],而細(xì)菌作為土壤微生物中的重要類群,其多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的變化更能夠反映土壤的質(zhì)量狀況[3].農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)在耕作措施和有機(jī)物料的輸入改變土壤理化性質(zhì)的同時,對土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了不同的影響[4].研究不同秸稈還田方式下土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律,對選擇合理的種植措施和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義.

    淡黑鈣土為吉林省西部的主要土壤類型,其主要特征為腐殖質(zhì)積累過程弱、含量低,因此其肥力效果相對較差[5].作為少數(shù)可受人為調(diào)控的農(nóng)田土壤培肥方式,秸稈還田越發(fā)受到重視.目前,秸稈還田也是該區(qū)域提升地力的有效手段之一,是土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分的重要來源[6].大量研究表明,玉米秸稈還田可有效改善土壤有機(jī)質(zhì)下降以及養(yǎng)分過量消耗等問題,有助于提升土壤肥力、增加作物產(chǎn)量[7-8].特別是作物秸稈還田后,可供微生物生命活動的有機(jī)物顯著增加,促進(jìn)了土壤微生物(真菌、細(xì)菌等)的代謝繁殖.陸思旭等[9]研究發(fā)現(xiàn),渭北地區(qū)旱地農(nóng)田土壤有機(jī)碳是影響微生物碳源代謝的主要因素,而免耕、深松、隔年輪耕為該區(qū)域適宜的耕作措施.李景等[10]對豫西保護(hù)性耕作土壤的研究發(fā)現(xiàn),免耕、深松覆蓋可改善土壤團(tuán)聚體的狀況,提高土壤微生物的多樣性指數(shù).但針對吉林省西部半干旱區(qū)耕作措施對玉米農(nóng)田土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響尚缺乏認(rèn)識,土壤微生物與生態(tài)環(huán)境間的響應(yīng)機(jī)制仍需探討.

    本研究針對不同玉米秸稈還田方式下,玉米農(nóng)田土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性變化特征,利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù),揭示了土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)分布規(guī)律及其與關(guān)鍵環(huán)境因子間的關(guān)系,為進(jìn)一步探明土壤微生物對不同秸稈還田方式的響應(yīng)機(jī)制以及建立適宜該區(qū)域的耕作制度提供了理論支撐與參考依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 研究區(qū)域概況

    大田試驗的地點位于吉林省白城市洮北區(qū)青山鎮(zhèn)生產(chǎn)村(N45°69′,E122°86′).研究區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候,年平均降水量為399.9 mm,年平均氣溫5.2℃,≥10℃活動積溫平均為2 996.2℃,無霜期平均為144 d,年平均日照時數(shù)為2 915 h.土壤類型為淡黑鈣土,基礎(chǔ)理化性質(zhì)為:土壤全氮含量1.04 g/kg,土壤全磷含量0.31 g/kg,土壤全鉀含量24.79 g/kg,土壤有機(jī)質(zhì)含量20.00 g/kg,pH=6.40.

    1.2 試驗設(shè)計

    試驗布設(shè)從2018年開始,連續(xù)耕作兩年.試驗采用秸稈全量還田方式,共設(shè)置4個處理:傳統(tǒng)耕作(NT,秸稈不還田+常規(guī)種植,作為對照CK);覆蓋+秸稈還田(CS);旋耕+秸稈還田(RS);旋耕-覆蓋(CRS,第一年覆蓋+第二年旋耕)輪耕處理.采用小區(qū)試驗,設(shè)3次重復(fù).每年各處理均于4月末播種,9月末收獲,常規(guī)田間管理.種植品種為翔玉998,播種密度70 000株/hm2,播種前施用復(fù)合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=28∶12∶14)作為基肥.

    1.3 樣本采集與處理

    為了評價連續(xù)兩個耕作季之后的土壤狀況,于2019年9月下旬玉米收獲后,在各處理樣地內(nèi)隨機(jī)取樣.每個處理設(shè)5個土壤采樣點,去除土壤表層植株,采集0~20 cm土壤樣品,用無菌袋收集.將每個處理所有樣品除去土壤中的根系、碎石及其他雜物,充分混勻后分成3份用于微生物多樣性研究.土壤樣本在凍存狀態(tài)下寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序.用于土壤酶活測定的樣品4℃保存,風(fēng)干樣品用于測定土壤理化性質(zhì).

    1.4 土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性指標(biāo)測定

    土壤pH值及養(yǎng)分(有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效氮、速效磷以及速效鉀)含量采用常規(guī)方法進(jìn)行測定.土壤脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測定,土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測定,蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測定[11-12].

    1.5 PCR擴(kuò)增及測序

    利用 E.Z.N.A.? soil DNA Kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)土壤試劑盒對供試樣品進(jìn)行土壤微生物總 DNA 的提取,采用細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) V3-V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)一步純化后進(jìn)行雙端測序.PCR 反應(yīng)條件為:95℃初變性3 min;95℃變性 30 s,55℃退火 30 min,72℃ 45 s,35個循環(huán);72℃延伸 10 min;4℃保溫.采用Illumina MiSeq PE300平臺(San Diego,CA,USA)進(jìn)行測序.原始測序序列使用Trimmlmatic軟件進(jìn)行質(zhì)控,使用FLASH軟件進(jìn)行拼接后去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列;去除模糊堿基;根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接.使用Uparse v7.1 (version 7.1 http:∥drive5.com/uparse/)軟件[13]對有效數(shù)據(jù)在97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行聚類分析;使用UCHIME軟件剔除嵌合體.基于Silva (SSU123) 16S rRNA數(shù)據(jù)庫,采用RDP分類算法(http:∥rdp.cme.msu.edu/)對每個16S rRNA基因序列進(jìn)行分類分析,置信閾值為70%.根據(jù)測序結(jié)果分析各個水平上統(tǒng)計樣品的群落結(jié)構(gòu).

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性數(shù)據(jù)利用DPS及Microsoft Excel 2017軟件進(jìn)行完全隨機(jī)分析.測序數(shù)據(jù)利用Mothur軟件[14]對序列進(jìn)行抽平,并計算Shannon,Simpson多樣性指數(shù)和Chao1豐富度指數(shù).利用R(v.4.0.3)軟件(R Development CoreTeam,2006) 對不同耕作條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的變化特征和其主要驅(qū)動因子進(jìn)行熱圖(heatmap)、非度量多維尺度和聚類分析.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同處理土壤化學(xué)性質(zhì)的比較

    不同處理土壤化學(xué)性質(zhì)的結(jié)果見表1.由表1可見,與CK相比各處理土壤養(yǎng)分含量均存在差異.各處理pH均為中性,且變化并不顯著,其中RS處理土壤pH最低、CRS則最高.從水解性氮含量來看,CS處理模式為最高,較CK提升了38.47%,而RS和CRS處理較CK分別提升了15.39%和7.70%.CS模式顯著提升了土壤有機(jī)質(zhì)含量,較CK提升32.08%,而CRS處理卻降低了12.5%.綜合分析結(jié)果,不同秸稈還田處理中,CS處理對土壤全氮/磷/鉀、速效鉀、有效氮及有機(jī)質(zhì)含量均具有明顯的提升作用;CRS處理模式則不同程度降低了相關(guān)指標(biāo).

    表1 不同還田方式下土壤化學(xué)性質(zhì)

    已有的研究表明,秸稈以不同方式還于土壤(覆蓋、旋混),使其被微生物分解的機(jī)會大大增加,可促進(jìn)土壤養(yǎng)分積累;秸稈在腐解的過程中,也會激活土壤中氮、磷和鉀等養(yǎng)分,進(jìn)而提高速效性養(yǎng)分[15-17].本研究中,旋混還田和免耕覆蓋還田方式不但有效增加了土壤有機(jī)碳含量,還改善了土壤pH,有利于植物生長;對比不同處理方式,免耕覆蓋秸稈還田模式對土壤養(yǎng)分總體提升更為顯著.

    2.2 不同處理對土壤酶活性的影響

    由表2可見,不同耕作措施結(jié)合秸稈還田后,均不同程度地改變了土壤的活性.在土壤蔗糖酶活性方面,CK處理為最高,其次為CS處理,CRS處理為最低;CS處理較CK略有降低,但未達(dá)到顯著水平.土壤脲酶活性則為CS處理最高,較CK處理提升了29.28%,RS次之;CRS處理活性最低,較CK降低5.88%.土壤酸性磷酸酶活性分析結(jié)果顯示,RS>CS>CK>CRS;RS處理較CK活性提升了31.33%,CS提升了20.62%.對比3種方式,CS、RS兩個處理均能夠顯著提高土壤脲酶酸性磷酸酶活性,輪耕模式(CRS)則極顯著降低了蔗糖酶活性,同時脲酶和酸性磷酸酶活性也大大下降.

    表2 不同處理土壤酶活性 U/g

    土壤酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)、養(yǎng)分含量和耕作方式有著緊密的聯(lián)系,也是評價土壤肥力的關(guān)鍵因素[18-20].秸稈還田后,可以增加土壤氮和碳的供應(yīng),從而導(dǎo)致脲酶和蔗糖酶活性均相應(yīng)改變.本研究中,不同秸稈還田方式下,免耕覆蓋還田和旋混還田均顯著提高了土壤蔗糖酶及脲酶活性,這主要是由于外源有機(jī)碳(秸稈)的添加,帶來了新的養(yǎng)分,通過微生物作用固存到土壤中.而輪耕模式則使酶活均呈下降趨勢,這主要是由于耕作方式的改變,導(dǎo)致土壤物理性狀發(fā)生改變,進(jìn)一步改變了土壤水、熱、氣的綜合作用效果,使整體酶活性較常規(guī)種植降低.

    2.3 不同處理對微生物多樣性的影響

    通過16SrRNA基因高通量測序,在97%相似度下降序列聚類分析物種分類單元(OTU),統(tǒng)計各OTU在不同樣品中的豐度信息并進(jìn)行α-多樣性分析[21-23],結(jié)果見表3.其中:Sobs指數(shù)是指實際觀測到的OTU數(shù)目;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要用來衡量物種的多樣性情況;Chao1指數(shù)主要用來衡量物種的豐富度;Coverage指數(shù)主要用來檢測測序?qū)ξ锓N的覆蓋度.根據(jù)多樣性指數(shù)可以看出,所有樣品的覆蓋度均在95%以上,說明取樣合理,所測結(jié)果有效可靠,可真實反映不同處理條件下土壤中的細(xì)菌群落組成[24-25].由表3可以看出,Shannon以及Chao1指數(shù)為CK>CRS>RS>CS,說明秸稈還田下的3種耕作方式(CS、RS、CRS)土壤群落物種多樣性均略低于常規(guī)種植(CK)方式.而Simpson指數(shù)在4種耕作條件下變化較低,說明秸稈還田耕作方式對細(xì)菌的均勻性起到的作用有限.通過秸稈還田結(jié)合免耕覆蓋、旋混旋耕等耕作措施,土壤的Shannon和Chao1指數(shù)均低于傳統(tǒng)耕作,而Simpson指數(shù)變化有限.這個結(jié)果側(cè)面說明本研究所設(shè)3種耕作措施可在一定程度上富集可分解秸稈的特定微生物種群,導(dǎo)致整體微生物群落發(fā)生改變.

    表3 不同處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

    2.4 不同秸稈還田方式對土壤細(xì)菌群落的影響

    2.3.1 土壤細(xì)菌綱水平上的比較

    各處理土壤細(xì)菌群落在綱水平上占主要數(shù)量的優(yōu)勢物種基本相同,前4位綱分別為Alphaproteobacteria(15.84%~20.64%),Actinobacteria(11.15%~14.95%),Gammaproteobacteria(12.39%~14.09%)以及Blastocatellia Subgroup_4(8.26%~12.24%) (見圖1).與CK(NT)比較發(fā)現(xiàn),在綱水平上,所占比率較低的Bacteroidia(CK 4.70%,其他5.30%±0.35%)、Saccharimonadia(CK 1.16%,其他2.71%±1.18%)、Verrucomicrobiae(CK 2.08%,其他2.56%±0.33%)占比一致增加,而Holophagae (CK 1.18%,其他0.56%±0.11%)占比一致減少,說明耕作措施以及秸稈還田對土壤細(xì)菌群落在綱水平上有一定影響.Holophagae在CK中所占比率分別高于RS 2.84倍和CRS 2.04倍,Acidobacteriia在CK中所占比率分別低于RS 0.59倍和CRS 0.52倍,說明這兩種綱受到旋混耕作措施的影響顯著.然而,Saccharimonadia在CS和RS中所占比率分別低于CK處理0.44倍和0.28倍,說明Saccharimonadia對不同秸稈還田方式的響應(yīng)更為顯著.

    圖1 不同處理樣本綱水平細(xì)菌群落組成

    2.3.2 土壤細(xì)菌科水平上的比較

    在科分類水平上,共檢測到土壤細(xì)菌362科,其中,CK有324科,CS有309 科,RS和CRS有302科.進(jìn)一步對任意一個樣品豐度高于1.0%的物種在科水平進(jìn)行熱圖(heatmap)分析,結(jié)果(見圖2)表明,前3種豐度最高的科為Pyrinomonadaceae(CK 9.38%,CS 8.73%,RS 5.72%,CRS 7.88%),Sphingomonadaceae(CK 8.04%,CS 7.24%,RS 9.76%,CRS 7.54%)以及Acidobacteria Subgroup_6(CK 7.69%,CS 9.33%,RS 5.22%,CRS 6.30%),在不同處理的土壤細(xì)菌群落所占比率為20.69%~25.31%.與CK比較,Pyrinomonadaceae,Burkholderiaceae,Holophagae Subgroup_7,Actinobacteria IMCC26256,Xanthomonadaceae等5科通過秸稈覆蓋還田、旋混還田等處理措施之后豐度一致減少,而Solibacteraceae,Blastocatellaceae,Rhodanobacteraceae,Saccharimonadales,Pedosphaeraceae,Rhizobiaceae,Micropepsaceae豐度一致增加.此外,與CK相比較,Acidobacteria Subgroup_6和Xanthobacteraceae僅在旋混還田處理中分別增加了32%和30%,而Rokubacteriales減少了51%.這些結(jié)果說明本研究中所設(shè)的3種不同秸稈還田結(jié)合耕作措施處理顯著改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu).

    圖2 不同處理樣本科水平豐度前30的群落熱圖(heatmap)

    已有研究表明,Rhodanobacteraceae細(xì)菌可以利用不同的碳基作為碳源,而Saccharimonadales細(xì)菌可促進(jìn)植物自身及其衍生有機(jī)物的降解.此外,Blastocatellaceae細(xì)菌與聚合物的碳代謝有關(guān).由于秸稈還田可直接增加各處理土壤的有機(jī)物含量,而這些有機(jī)物可被微生物降解,進(jìn)而使有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分等物質(zhì)在秸稈還田的土壤中較常規(guī)種植土壤增加.

    2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子的關(guān)系

    基于各OTU的Bray-curtis聚類圖譜分析(見圖3)表明,在OTU水平上4種不同耕作處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(最大差異為30%).與常規(guī)耕作比較,OTU水平上群落結(jié)構(gòu)變化為CRS>RS>CS,說明土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到耕作措施的影響較大.

    圖3 不同處理樣本細(xì)菌群落聚類分析

    利用非度量多維尺度分析和聚類 (NMDS)結(jié)合環(huán)境因子進(jìn)行的相關(guān)性分析(見圖4)發(fā)現(xiàn),土壤中pH、速鉀、全氮、有機(jī)質(zhì)含量以及土壤脲酶是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要驅(qū)動因子(P<0.01),其中,土壤中有機(jī)質(zhì)和全氮含量對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化貢獻(xiàn)度最大.

    3 結(jié)論

    本研究針對吉林省西部半干旱區(qū)典型淡黑鈣土地區(qū)農(nóng)田土壤,采用高通量測序方法,對不同耕作措施結(jié)合秸稈還田后土壤養(yǎng)分變化、土壤酶活性、微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:(1)秸稈覆蓋還田與旋混還田均可提高土壤中氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)含量并降低土壤pH;(2)秸稈覆蓋還田與旋混還田均能夠有效地富集 Rhodanobacteraceae,Saccharimonadales,Solibacteraceae,Blastocatellaceae細(xì)菌;(3)pH、速鉀、全氮、有機(jī)質(zhì)含量以及土壤脲酶活性是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要驅(qū)動因子(P<0.01).以上研究為進(jìn)一步探明土壤微生態(tài)對秸稈還田的響應(yīng)機(jī)制,以及建立適宜吉林省西部半干旱區(qū)農(nóng)田的秸稈還田模式提供了理論支撐與科學(xué)依據(jù).

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