LAMP法、ADA法在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用比較

陳沃慶

【關(guān)鍵詞】 LAMP法 ADA法 結(jié)核性胸膜炎

[Abstract] Objective： In order to better understand the situation of tuberculous pleurisy in patients， LAMP and ADA were used to diagnose patients in this study and their diagnostic value was discussed. Method： A total of 80 patients with suspected tuberculous pleurisy in our hospital from May 2019 to April 2020 were selected. All patients were tested by LAMP and ADA. The clinical diagnostic criteria were taken as the gold standard， ADA and LAMP in the diagnosis of tuberculous pleurisy were analyzed， and the diagnostic efficacy of ADA and LAMP in the diagnosis of tuberculous pleurisy was compared. Result： The accuracy of ADA and LAMP in the diagnosis of tuberculous pleurisy were 81.25% and 51.25% respectively. The sensitivity of ADA in the diagnosis of tuberculous pleurisy was 91.2%， which was higher than 44.1% of LAMP （P<0.05）. The specificity of ADA in diagnosis of tuberculous pleurisy was 25.0%， which was lower than 91.7% of LAMP （P<0.05）. Conclusion： In the diagnosis of tuberculous pleurisy， there are some differences between the sensitivity and specificity of LAMP and ADA. LAMP can effectively improve the specificity. Therefore， this diagnostic method can effectively help doctors improve the judgment ability of patients’ disease， formulate accurate and effective treatment methods， and improve the current state of patients， clinical application should be further promoted.

[Key words] LAMP ADA Tuberculous pleurisy

First-author’s address： Jiangmen Central Hospital of Guangdong Province， Jiangmen 529000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.036

結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核分枝桿菌和代謝的產(chǎn)物感染胸膜腔之后發(fā)生的炎癥性病變。臨床中這種疾病一般會伴有胸腔積液，并且發(fā)展較為迅速，臨床中的診斷主要有免疫學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、胸水檢查等[1]。細菌學(xué)和組織病理學(xué)雖然也有檢測的效果，但組織病理學(xué)檢查會對患者產(chǎn)生一定的創(chuàng)傷，且操作過程比較復(fù)雜，所以一般不實施[2]。細菌培養(yǎng)陽性概率較低，因此尋找患者容易接受并且操作簡單，同時伴有特異性、敏感性較高的診斷方式在臨床中有一定的意義[3]。隨著免疫學(xué)、生物學(xué)的發(fā)展，免疫檢測和各種分子技術(shù)是診斷結(jié)核性胸膜炎的新方式[4]。腺苷脫氨酶（adenosine deaminase， ADA）是較多學(xué)者公認的診斷指標。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）屬于新型的核酸檢驗技術(shù)，和傳統(tǒng)的技術(shù)進行對比，其只需恒定溫度就能進行擴增反應(yīng)[5]。以上幾種方式檢測對患者的價值暫不清楚，所以本次研究的目的是為了探討其價值，提供臨床依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5月-2020年4月本院疑似結(jié)核性胸膜炎的患者80例，男55例，女25例;年齡35～78歲，平均（55.3±2.7）歲。（1）納入標準：①患者病理學(xué)、影像學(xué)、細菌學(xué)診斷確診為結(jié)核性胸膜炎;②參與研究前沒有接受過化療、放療、手術(shù)治療。（2）排除標準：①患者的依從性較差;②對于每項檢測均有排斥感;③腎、肝、心功能異常?；颊呔獣员敬窝芯?，并簽署同意書表示自愿參與，同時經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 ADA法 使用的是Olympus AU5431型全自動生化分析儀，由日本Olympus公司所提供，試劑使用的是原裝配套，具體操作嚴格按照說明書進行。將5 mL的胸腔積液放置到黃色的生化管中，離心10 min，3 000 r/min分離血清，選取上清液進行測定。

1.2.2 LAMP法 使用的廣州迪澳生物科技有限公司生產(chǎn)的恒溫擴增儀，以及原裝的試劑盒。將等待檢驗的痰樣本放置到4%氫氧化鈉中，渦旋振蕩15 s，室溫放置15 min，吸取1 mL加入帶旋蓋離心管中，時間為5 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定為12 000 r/min，將上清液丟棄，加入DNA提取液100 μL，渦旋混勻15 s，恒溫100 ℃加熱10 min，溫度保持在100 ℃，離心2 min（12 000 r/min），選取上清液進行備用。核酸擴增反應(yīng)體系：將上清液2 μL放置到反應(yīng)管中，每支反應(yīng)管中都包含密封液20 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、反應(yīng)液22 μL，離心5 s，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，擴增儀溫度保持在63 ℃，時間為45 min。

1.3 觀察指標及判定標準 （1）ADA法對結(jié)核性胸膜炎診斷情況。（2）LAMP法對結(jié)核性胸膜炎診斷情況。（3）比較ADA法和LAMP法對結(jié)核性胸膜炎的診斷效能。金標準的診斷標準為以《肺結(jié)核診斷》（WS 288-2017）為主的影像學(xué)提示胸腔積液（干性胸膜炎可無異常），同時滿足以下任何一條，即可確診：胸膜病理檢查支持結(jié)核;胸水抗酸桿菌陽性2次;胸水抗酸桿菌陽性1次，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性1次。ADA法結(jié)核陽性的判定標準為：ADA 45 U/L。LAMP法結(jié)核判定標準為結(jié)果顯示為S型擴增曲線，可以定為陽性，說明包含結(jié)核分枝桿菌，相反就是陰性，并不包含。診斷準確率=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%;靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%;特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADA法對結(jié)核性胸膜炎診斷情況 ADA法診斷結(jié)核性胸膜炎的準確率為81.25%，見表1。

2.3 ADA法和LAMP法對結(jié)核性胸膜炎診斷效能比較 ADA法診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為91.2%、特異度為25.0%;LAMP法診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為44.1%、特異度為91.7%。ADA法的靈敏度高于LAMP法（P<0.05），LAMP法特異度高于ADA法（P<0.05），見表3。

結(jié)核病屬于慢性傳染性疾病的一種，是由結(jié)核分枝桿菌引起的，屬于三大傳染病中的一種[6]。從1940年開始，抗結(jié)核藥物不斷的制作出來，全球結(jié)核病情被控制，病死率、患病率、感染率有所下降[7]。但近幾年，結(jié)核病再次席卷而來，病情更加嚴重[8]。2016年的報告顯示，2015年全球大約有1 050萬結(jié)核病新發(fā)患者，其中大約有145萬人因為結(jié)核病死亡[9]。我國患病人數(shù)在世界中排名第二，僅低于印度，其發(fā)病率為68/100 000，病死率為39/100 000;2016年我國新發(fā)生結(jié)核病的人員有90.1萬人，報告的案例有80.4萬例，人民群眾的生命和健康受到威脅，所以結(jié)核防治工作在臨床中有一定的意義[10]。

結(jié)核疾病中，結(jié)核感染的主要表現(xiàn)是結(jié)核性胸膜炎，是繼淋巴結(jié)核之后第二位肺外結(jié)核病[11]。結(jié)核性胸膜炎主要的表現(xiàn)是胸腔積液，胸膜活檢病理、胸水培養(yǎng)、胸水查抗酸桿菌等作為其確診依據(jù)，胸膜病理和胸水查抗酸桿菌最終的結(jié)果陽性率并不高，結(jié)核桿菌培養(yǎng)的時間比較長，誤診、漏診、延誤診斷的事件易發(fā)生。漏診、延誤治療都會導(dǎo)致患者的病情加重，病死概率也會有所增加[12]。使用抗結(jié)核治療會出現(xiàn)較為嚴重的不良反應(yīng)。所以為了更好地增加診斷結(jié)核性胸膜炎的概率，需要一種特異度、靈敏度均較高、快速、簡單的檢查方式，以早期診斷和治療[13]。通過不斷的研究，使用LAMP技術(shù)對痰涂陰肺結(jié)核以及肺結(jié)核進行診斷，其概率較高，但是對于結(jié)核性胸膜炎的相關(guān)報道較少，故本次研究的目的為探討其對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值[14]。

LAMP技術(shù)在2000年被日本學(xué)者發(fā)明，屬于較為新型的一種恒溫體外核酸擴增技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，主要依賴的是兩種特異的內(nèi)部引物識別靶基因和兩條特異的外部引物的6個區(qū)域，使用具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在溫度為61～65 ℃的環(huán)境中恒溫快速擴增DNA分子[15-16]。屬于新型的檢測核酸的方式，這種操作方法不僅具有特異性高、擴增產(chǎn)物容易檢驗、產(chǎn)物大、擴增反應(yīng)快、操作簡單等優(yōu)勢，還可以為快速病原學(xué)檢驗提供一定的幫助。這項技術(shù)在近幾年的結(jié)核診斷中具有良好價值[17]。

關(guān)于結(jié)核性胸膜炎使用LAMP診斷的價值目前臨床中并沒有詳細的描述，樣本量較少，在研究過程中使用的引物是自行設(shè)計的，同時實施H37Rv菌株陽性對照檢測，檢測的方法不僅操作繁瑣且標準化不統(tǒng)一，難以全面開展，所以如果可以研究出簡易方便、標準化的方法，鑒定結(jié)核性胸膜炎中所包含的胸腔積液結(jié)核桿菌，在臨床中具有重要的意義[18]。在本次研究過程中，通過使用LAMP法對結(jié)核性胸膜炎患者實施胸腔積液結(jié)核桿菌的檢驗，和胸膜病理活檢、胸水ADA[19-20]。

通過使用ADA可以有效增快底物腺苷的分解速度、氨或者次黃苷等生成量，還可以幫助終產(chǎn)物尿酸生成量改變，實施淋巴細胞、紅細胞、體液、血清的ADA活性測定。在1978年的學(xué)者首先對胸腔積液ADA活性可以作為鑒別和診斷胸腔積液以及診斷胸膜炎的一種依據(jù)。發(fā)生結(jié)核性胸膜炎過程中，宿主可以根據(jù)細胞免疫有效的抵抗結(jié)核病，ADA在單核細胞成熟成為巨噬細胞以及淋巴細胞的分化中，均會起到作用，因為受到細胞免疫的刺激，所以淋巴細胞會不斷增加，所以ADA在胸腔積液中的含量會不斷增加，癌性胸腔積液過程中，ADA的活性會降低，抑制T淋巴細胞增殖。所以在研究過程中，結(jié)核性胸腔積液中主要包含的是ADA2、ADA1，但是這種酶細胞來源并不確定，胸腔中的問皮細胞和單核巨噬細胞可能性較大。ADA的活動雖然可以作為鑒別胸腔積液的主要標志物，但是效果遠沒有LAMP法好，本研究結(jié)果顯示，ADA法診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為91.2%、特異度為25.0%;LAMP法診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為44.1%、特異度為91.7%。ADA法的靈敏度高于LAMP法（P<0.05），LAMP法的特異度高于ADA法（P<0.05），因為ADA在檢測中具有一定的活性所以敏感度會高于LAMP法，但是LAMP法操作過程比較簡單，對于儀器設(shè)備要求比較低，檢測出的最終結(jié)果比較清晰，所以特異度高于ADA法，LAMP法作為臨床診斷結(jié)合新胸膜炎有一定的價值性。

綜上所述，在結(jié)核性胸膜炎診斷中，LAMP法可以有效提高特異度，幫助患者得到更加準確的治療，臨床上應(yīng)當進一步推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2020-08-26） （本文編輯：姬思雨）