miR-34a及其下游因子Bcl-2、TGF-β1在膽管癌發(fā)展中的作用

徐志誠 陳曉寧 李春海 王曉東

6月-2018年6月86例本院收治的膽管癌患者（試驗(yàn)組）及86例健康人（對照組）的資料，并取其血清利用實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）測試miR-34a表達(dá)水平，同時檢測調(diào)控因子Bcl-2、TGF-β1的表達(dá)量。結(jié)果：試驗(yàn)組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達(dá)量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）;不同miR-34a表達(dá)程度膽管癌患者性別、年齡、分化程度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;miR-34a高表達(dá)患者TNM分期、Bcl-2、TGF-β1與miR-34a低表達(dá)患者比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。試驗(yàn)組化療后miR-34a、TGF-β1及Bcl-2表達(dá)量均明顯低于化療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），膽管癌患者血清miR-34a與Bcl-2、TGF-β1均呈正相關(guān)（r=0.872、0.876，P=0.041、0.003）。結(jié)論：膽管癌患者miR-34a表達(dá)量明顯高于健康人，可能與調(diào)控下游Bcl-2、TGF-β1的表達(dá)量有關(guān)，此外miR-34a、Bcl-2及TGF-β1隨患者的治療活動變化產(chǎn)生相應(yīng)改變，可見三者可作為膽管癌診療的潛在位點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 膽管癌 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 化療治療 相關(guān)性分析

[Key words] Cholangiocarcinoma Regulatory network Chemotherapy Correlation analysis

First-author’s address： Jiamusi Central Hospital， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.035

膽管癌是一種源于肝外膽管的惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率逐漸上升[1-2]。目前臨床上外科手術(shù)是治療該病的主要方法，但是到了癌癥晚期，腫瘤分化程度高，手術(shù)治療效果往往較差，而化療成為治療該病晚期主要的治療方法[3]。然而，大量研究報道，膽管癌患者對化療不敏感，且治療效果較差，可能與miR-34a及其下游調(diào)控的Bcl-2、TGF-β1因子存在密切相關(guān)性[4-5]。故研究miR-34a在膽管癌患者的表達(dá)及其化療前后變化，在一定程度上可提高患者的臨床治療效果并對患者的遠(yuǎn)期預(yù)后具有重大的意義。鑒于此，本中心分析miR-34a及其的下游Bcl-2、TGF-β1因子的表達(dá)及其化療前后變化，為臨床進(jìn)一步提高膽管癌的治療提供新的理論依據(jù)和研究方向?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年6月-2018年6月本院收治的86例膽管癌患者（試驗(yàn)組）及同期于本院體檢的86例健康人（對照組）的資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理證實(shí)為膽管癌;年齡25～75周歲;無其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他重大器官功能不全;免疫功能缺陷;存在惡病質(zhì)。入選人員收集資料均完整，且知情并同意本次研究，并通過本院倫理委員會的認(rèn)證。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 試劑：miR-34a（上海吉瑪科技有限公司），細(xì)胞裂解液（美國Initrogen公司），miR-34a提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司），miR-34a逆轉(zhuǎn)錄引物及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），Bcl-2、TGF-β1試劑盒（Santa公司，美國）。儀器：實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（美國ABI公司），低溫高速離心機(jī)（美國Eppendorf公司），酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（Infinite F 50，帝肯公司，瑞士）

1.3 方法 （1）miR-34a的提?。喝山M清晨空腹靜脈血各5 mL，離心分離后取血清，加入等體積的細(xì)胞裂解液。再12 000 r/min離心10 min加入氯仿。然后進(jìn)行震蕩，12 000 r/min離心30 s，取水相層，并加入其1/3的無水乙醇，倒入吸附柱，再進(jìn)行12 000 r/min離心30 s。重復(fù)過柱遴選后，加入500 μL去蛋白液，再進(jìn)行12 000 r/min離心30 s。而后加入漂洗液，進(jìn)行12 000 r/min離心120 s，向吸附柱中加入30 μL去離子水，在室溫下放置12 s后，再進(jìn)行12 000 r/min離心120 s得到miR-34a。（2）qRT-PCR：反應(yīng)條件為95 ℃，10 s、20 s;62 ℃，40 s，共40個循環(huán)，采用相對定量法測試miR-34a的表達(dá)量。獲取兩組研究對象的外周靜脈血5～7 mL，加入抗凝管，然后放入離心機(jī)，3 000 r/min的速度離心，分離上清液，放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。具體操作方法按照試劑盒的方法操作進(jìn)行Bcl-2、TGF-β1的檢測。（3）化療藥物：吉西他濱（生產(chǎn)企業(yè)：ELI LILLY AND COMPANY，批準(zhǔn)文號：注冊證號H20110535，規(guī)格：200 mg）進(jìn)行化療。（4）測定miR-34a的表達(dá)量高于中位數(shù)的定義為高表達(dá)，低于中位數(shù)的定義為低表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo) 比較兩組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達(dá)量，比較不同miR-34a表達(dá)情況膽管癌患者臨床資料，比較試驗(yàn)組化療前后miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達(dá)量，分析miR-34a與其下游因子的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);采取Pearson相關(guān)分析評價miR-34a與其下游因子的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 試驗(yàn)組，男49例，女37例;年齡37～59歲，平均（48.24±7.23）歲。對照組，男48例，女38例;年齡37～60歲，平均（48.31±7.35）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達(dá)量比較 試驗(yàn)組miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達(dá)量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表1。

2.4 試驗(yàn)組化療前后miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達(dá)量比較 試驗(yàn)組化療后miR-34a、TGF-β1及Bcl-2表達(dá)量均明顯低于化療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表3。

3 討論

膽管癌是常見的惡心腫瘤之一，其主要的臨床表現(xiàn)為黃疸、膽囊腫大、肝臟損害、膽道感染和出血等，嚴(yán)重危及患者的生命安全[6]。有研究報道，該病病因可能與膽管結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎等疾病有關(guān)，目前臨床上治療該病的方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療等方法，其中手術(shù)治療是針對早期病例的有效治療方法，而放射治療、化學(xué)治療是針對膽管癌晚期患者的治療方法[7-8]。但文獻(xiàn)[9-10]報道，膽管癌晚期患者進(jìn)行化療時，往往效果較差，患者的耐藥性較差，嚴(yán)重影響治療效果，因此探究膽管癌患者弱化療性的原因?qū)δ懝馨┗颊呔哂兄卮蟮呐R床意義。

目前miR-34a為多種腫瘤的有效診斷指標(biāo)之一。此外同時有研究報道，膽管癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移性與miR-34a關(guān)系密切[11-12]。而最新的研究也證實(shí)了miR-34a同樣參與了膽管癌患者對化療藥物的耐藥性[13]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）已經(jīng)被證實(shí)參與多種癌癥的發(fā)生，如乳腺癌、子宮頸癌、肝細(xì)胞癌等，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化同樣參與了膽管癌的發(fā)生。而miR-34a通過調(diào)節(jié)其下游的TGF-β1的過表達(dá)，誘導(dǎo)了腫瘤的發(fā)生并促進(jìn)了EMT的發(fā)生從而參與了膽管癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。而本研究結(jié)果也證實(shí)了膽管癌患者血清miR-34a和TGF-β1的表達(dá)量均高于健康人群，此外，miR-34a表達(dá)與TNM分期有密切的關(guān)系，且隨著膽管癌患者臨床分期的進(jìn)展，miR-34a表達(dá)逐漸升高。證實(shí)了miR-34a和TGF-β1參與了膽管癌的病理過程，佐證了既往的研究[14]。

而Bcl-2作為調(diào)控抗凋亡蛋白家族成員，其量的過度表達(dá)同樣參與了膽管癌的轉(zhuǎn)移。而本研究結(jié)果也提示膽管癌患者的血清Bcl-2高于健康對照組，同時了證明了之前研究關(guān)于Bcl-2參與了膽管癌發(fā)展的結(jié)論[15]。

同樣有研究證實(shí)了miR-34a參與了膽管癌抗化療性，其同樣TGF-β1和Bcl-2來實(shí)現(xiàn)的，前者是通過EMT獲得了間葉細(xì)胞的侵襲能力來降低化療藥物的敏感性，而Bcl-2則通過抗凋亡作用來降低膽管癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性[16]。而本研究結(jié)果顯示化療前后上述三項(xiàng)指標(biāo)均較治療前降低，與既往的研究結(jié)果相似[17]。

最后，本研究結(jié)果顯示miR-34a與Bcl-2、TGF-β1均呈正相關(guān)（P<0.05），足見miR-34a通過一系列機(jī)體內(nèi)的生物信號傳導(dǎo)途徑，達(dá)到了調(diào)控Bcl-2、TGF-β1量的目的，最終實(shí)現(xiàn)了調(diào)控膽管癌發(fā)生發(fā)展以及對抗化療藥物的生物效應(yīng)，既往的研究也得出類似的研究結(jié)論[18]。

綜上所述，miR-34a通過調(diào)控機(jī)體Bcl-2及TGF-β1的過表達(dá)參與了膽管癌的發(fā)生及預(yù)后，其可作為臨床評估膽管癌診療的重要指標(biāo)，有成為膽管癌治療靶點(diǎn)的潛在可能。但本研究為單中心研究且研究個體量偏少，需要多中心聯(lián)合大樣本量來進(jìn)一步證實(shí)miR-34a在膽管癌的角色定位。另外，microRNA的進(jìn)一步分類研究也是下一步的研究重點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-08-17） （本文編輯：程旭然）