唐海婷，張 才，張永平，楊隆恩，古敏晴，李亞娟，顏 玲，宋 采

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雌、雄海馬抗疲勞和改善記憶障礙比較

唐海婷，張 才，張永平，楊隆恩，古敏晴，李亞娟，顏 玲，宋 采

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120）

【】比較雌、雄海馬對小鼠抗疲勞和改善記憶障礙的不同作用。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測小鼠抗疲勞能力，將小鼠分3組，1組喂食普通飼料，另外2組分別喂食含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%雌、雄海馬的飼料，共喂食6周。跳臺實(shí)驗(yàn)檢測小鼠記憶能力，將小鼠為4組，正常組與乙醇組喂食普通飼料，另外2組分別喂食含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%雌、雄海馬的飼料，共喂食6周。體積分?jǐn)?shù)30%乙醇灌胃乙醇組和雌、雄海馬組誘導(dǎo)小鼠記憶損傷模型?？蛊趯?shí)驗(yàn)中，與對照組相比，喂食雄海馬的小鼠在棒時間顯著延長（＜0.05），其血清中乳酸含量顯著降低（＜0.05）；而喂食雌海馬的小鼠在棒時間和血清乳酸含量均無明顯改變。乙醇記憶損傷實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，模型組小鼠跳下平臺的潛伏期顯著下降（＜0.01），錯誤數(shù)（次）顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，喂食雄海馬的小鼠跳下平臺的潛伏期顯著升高（＜0.05），錯誤數(shù)（次）顯著減少（＜0.05），腦組織中的乙酰膽堿酯酶活性顯著降低（＜0.05）；而喂食雌海馬的小鼠上述指標(biāo)均無改變。在增強(qiáng)小鼠抗疲勞能力和改善記憶方面，雄海馬的功效顯著而雌海馬無效。

雌、雄海馬；抗疲勞；改善記憶

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，疲勞的產(chǎn)生對人們生活質(zhì)量產(chǎn)生了越來越大的影響。延緩疲勞發(fā)生，迅速消除疲勞，對人們身體健康極為重要[1]。學(xué)習(xí)記憶是大腦重要功能之一，也是人類賴以生存和進(jìn)化的關(guān)鍵。由外力、環(huán)境污染以及酒精等引起的記憶損傷，特別是因酒精引起的記憶損害越來越多，會嚴(yán)重危及人類的正常生活工作，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于海洋的獨(dú)特環(huán)境，許多海洋藥物具有高效的活性和特殊的藥理作用機(jī)制，在抗疲勞和記憶改善方面的作用日益受到人們的重視[2]。

海馬入藥歷史悠久，藥理作用廣泛，除性激素樣作用[3-4]外，還具有抗炎[5]、抗氧化、抗疲勞和抗癌[6]、抗抑郁[7]等作用。三斑海馬能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間，減少運(yùn)動過后的乳酸生成并加速乳酸代謝，其抗疲勞效果優(yōu)于人參[8]?！吧詈｝垺笔且环N含有海馬有效成分的水丸，服用后能顯著提高人體無氧功率、定量負(fù)荷以及極限負(fù)荷工作能力[9]。藥理研究發(fā)現(xiàn)海馬水、醇提取物能在一定程度上改善記憶[10]。小鼠妊娠晚期，一次性灌胃谷氨酸單鈉，可明顯降低60日齡仔鼠Y迷宮學(xué)習(xí)記憶能力[11]。從三斑海馬中分離出的一種肽類初制劑，可拮抗谷氨酸單鈉的上述作用[12]。三斑海馬中分離出的一種小分子多肽能抵抗Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，有望治療老年癡呆[13]。此外，海馬富含DHA、EPA ω-3多不飽和脂肪酸對大腦有很好保護(hù)作用的成分[14]。

目前對《中國藥典》2015版收錄的5種高藥用價值海馬的研究，主要是三斑海馬，但三斑海馬養(yǎng)殖較為困難，難以滿足市場需求。而線紋海馬因抗病能力強(qiáng)、存活率高、生長速率快優(yōu)點(diǎn)[15]，成為近年來的養(yǎng)殖首選。同時線紋海馬較三斑海馬異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸含量高，這些成分對維護(hù)機(jī)體健康，增強(qiáng)免疫力有重要作用[16]。目前關(guān)于線紋海馬的研究主要集中在抗炎[17]方面，且傳統(tǒng)中藥習(xí)慣將線紋海馬雌雄配對入藥[18]，單雄性或單雌性海馬功效研究尚未見報道。本研究以單雌性和單雄性海馬飼喂小鼠，利用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和急性乙醇記憶損傷模型，分析雌、雄海馬對小鼠增強(qiáng)疲勞耐受和改善記憶的功效，并通過測定血清中乳酸（LA）含量反映小鼠疲勞程度，腦組織中乙酰膽堿酯酶（AChE）以及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性反映小鼠與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的膽堿能系統(tǒng)變化，以期進(jìn)一步闡明線紋海馬功效的機(jī)制，為線紋海馬保健品和藥品開發(fā)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

無特定病原體（SPF級）六周齡雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量22 ~ 24 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司（合格證號：37009200008874）。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度（23±1）℃，濕度（50±10）%，12 h光照（7：00—19：00），自由飲食和攝水。小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn)，此時小鼠體質(zhì)量均值為33 g。線紋雌海馬、線紋雄海馬，由深圳市萬騏海洋生物科技有限公司提供。YLS-4C 轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；XR-3TB 跳臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司；高速冷凍臺式離心機(jī)，Beckman公司；RT-6100酶標(biāo)儀，Rayto公司。無水乙醇，成都市科龍化工試劑廠。ELISA試劑盒LA、AChE、ChAT，產(chǎn)品批號分別為20170705536T、20170711258T、20170702163T，由江蘇雨桐生物科技有限公司提供。海馬飼料由海馬粉末與普通粉末飼料按比例混合均勻，混合后的飼料4℃下儲存，小鼠食用飼料每天更新，避免海馬氧化。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 海馬抗疲勞實(shí)驗(yàn)共分3組（= 15）：對照組飼喂普通飼料，雌海馬組飼喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組飼喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實(shí)驗(yàn)共分4組（= 15）：對照組以及乙醇組飼喂普通飼料，雌海馬組飼喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%的雌海馬飼料，雄海馬組飼喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶于水，故采取拌飼料喂食的方式，該方法成熟，應(yīng)用廣泛[19]。兩個實(shí)驗(yàn)均喂食海馬飼料6周，記錄初始體重，之后每周末稱重一次。

1.2.2 小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)[20]先進(jìn)行為期3 d的適應(yīng)性預(yù)實(shí)驗(yàn)，每天將小鼠放置在轉(zhuǎn)棒疲勞儀上，設(shè)置轉(zhuǎn)棒疲勞儀轉(zhuǎn)速20 r/min，時間10 min。如有小鼠中途掉落，則將小鼠放回轉(zhuǎn)棒上繼續(xù)適應(yīng)。正式實(shí)驗(yàn)中，設(shè)定轉(zhuǎn)速40 r/min，記錄5 min內(nèi)小鼠從開始到掉棒的時間。本實(shí)驗(yàn)為一次性測試結(jié)果。

1.2.3 跳臺實(shí)驗(yàn)[21]體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實(shí)驗(yàn)前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海馬組，造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳臺實(shí)驗(yàn)時，將小鼠放置在平臺上，自由探索試驗(yàn)箱3 min，后將小鼠放置在箱內(nèi)銅柵上，銅柵通電（30 mA恒流）以刺激小鼠找到平臺。24 h后正式測試，記錄5 min內(nèi)小鼠第一次跳下平臺的時間，即潛伏期，以及5 min內(nèi)小鼠跳下平臺的總數(shù)（次），即錯誤數(shù)（次）。本實(shí)驗(yàn)為一次性測試結(jié)果。

1.2.4 樣品采集 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)束30 min后，小鼠斷頭頸部取血，全血靜置0.5 h，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10 min，保存血清于-80 ℃冰箱。跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，小鼠斷頭，迅速將全腦剝離，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.2.5 生化指標(biāo)測定 根據(jù)ELISA試劑盒說明書，測定抗疲勞實(shí)驗(yàn)小鼠血清LA 含量，記憶障礙實(shí)驗(yàn)小鼠全腦AChE和ChAT活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 雌、雄海馬對小鼠體質(zhì)量影響

圖1可知，實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠體質(zhì)量沒有差異（＞0.05）。飼養(yǎng)6周后，各組小鼠的體質(zhì)量均有增加，但與對照組相比，飼喂雌、雄海馬的小鼠體質(zhì)量均無顯著差異（＞0.05），說明雌、雄海馬對小鼠的正常生長并無影響。

圖1 雌、雄海馬對小鼠體質(zhì)量的比較

2.2 雌、雄海馬飼喂對小鼠抗疲勞耐受時間影響

小鼠從開始到掉棒的持續(xù)時間越長，表示小鼠耐受時間越長，抗疲勞能力越強(qiáng)。圖2顯示，與對照組相比，雌海馬組的耐受時間無顯著差異（＞0.05），雄海馬組的耐受時間則顯著升高（=7.353，＜0.05），說明僅雄海馬能增強(qiáng)小鼠抗疲勞能力。

*，VS對照組control group P＜0.05

2.3 雌、雄海馬飼喂對小鼠血清中乳酸LA影響

圖3顯示，雄海馬對血清乳酸水平有顯著效果（（2,42）=3.465，＜0.05）。與對照組相比，雌海馬組的血清LA水平無顯著差異（＞0.05），雄海馬組的血清LA水平則顯著降低（＜0.05）；與雌海馬組相比，雄海馬組的血清LA水平也顯著降低（＜0.05）。結(jié)果表明雄海馬能有效降低運(yùn)動疲勞后小鼠體內(nèi)LA含量。

*，VS對照組P＜0.05；#，VS雌海馬組P＜0.05

2.4 雌、雄海馬對小鼠跳臺潛伏期和錯誤數(shù)（次）影響

圖4顯示，雄海馬對乙醇誘導(dǎo)的跳臺潛伏期有顯著改善效果（=29.364，＜0.01）。與對照組相比，乙醇組的潛伏期顯著降低（＜0.01）；與乙醇組相比，雌海馬組的潛伏期無明顯升高（＞0.05），雄海馬組的潛伏期則顯著升高（＜0.01）。表明30%乙醇灌胃能造成小鼠記憶損傷，雄海馬能顯著改善這種記憶障礙，而雌海馬無效。

**，VS對照組P＜0.01；##，VS乙醇組P＜0.01

圖5顯示，海馬對乙醇誘導(dǎo)的跳臺錯誤數(shù)（次）有顯著改善效果（（3,56）=12.315，＜0.01）。與對照組相比，乙醇組的錯誤數(shù)（次）顯著升高（＜0.01）；與乙醇組相比，雌、雄海馬組的錯誤數(shù)（次）均顯著降低（＜0.05）。表明對于乙醇造成的記憶損傷，雌、雄海馬能部分進(jìn)行改善。

**，VS對照組P＜0.01；#，VS乙醇組P＜0.05

2.5 雌、雄海馬對小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶AChE和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶ChAT活性影響

圖6顯示，海馬對乙醇誘導(dǎo)的AChE活性有顯著改善效果（（3,56）=13.535，＜0.05）。與對照組相比，乙醇組AChE活性顯著升高（＜0.01）；與乙醇組相比，雄海馬組AChE活性顯著降低（＜0.05）。結(jié)果表明，乙醇能導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)AChE活性上升，雄海馬能逆轉(zhuǎn)這一影響。

**，VS對照組P＜0.01；#，VS乙醇組P＜0.05

圖7顯示，與對照組相比，乙醇誘導(dǎo)使得腦內(nèi)ChAT活性顯著降低（（3,56）=5.656，＜0.05）；但是與乙醇組相比，雌、雄海馬兩個組ChAT活性均沒有變化（＞0.05）。結(jié)果表明，乙醇造成的記憶損傷會使腦內(nèi)ChAT活性下降，但是雌、雄海馬對這一變化并無改善作用。

*，VS對照組control group P＜0.05

3 討論

運(yùn)動耐力是反映機(jī)體疲勞最直接客觀的指標(biāo)，運(yùn)動耐力的增強(qiáng)是抗疲勞能力增強(qiáng)的最有力表現(xiàn)。小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)迫全身消耗性實(shí)驗(yàn)，其運(yùn)動時間的長短是衡量疲勞的一個指標(biāo)[22]。乳酸是機(jī)體在無氧條件下進(jìn)行糖代謝的終產(chǎn)物，劇烈運(yùn)動時機(jī)體會產(chǎn)生大量乳酸，乳酸的積累會導(dǎo)致機(jī)體疲勞，可反映機(jī)體疲勞程度[23]。在本研究中，雄海馬表現(xiàn)出對血乳酸的清除作用，提高了機(jī)體對氧的利用能力，降低了無氧酵解程度，從而延長了小鼠運(yùn)動耐受時間。彭汶鐸等[24]也發(fā)現(xiàn)小鼠連續(xù)14 d灌胃海馬酶解提取物，在一次性運(yùn)動和遞增運(yùn)動量疲勞模型中，小鼠血清中乳酸含量均顯著降低。但是飼喂雌海馬的小鼠，其耐受時間與血清乳酸含量與對照組相比，并無明顯變化，證明單獨(dú)的雌海馬不能改善小鼠的運(yùn)動機(jī)能，沒有抗疲勞作用。

跳臺實(shí)驗(yàn)是檢測動物學(xué)習(xí)記憶能力的常用方法，跳臺潛伏期和錯誤數(shù)（次）是評價動物學(xué)習(xí)記憶的重要指標(biāo)。潛伏期長，錯誤數(shù)（次）少，表明動物的學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)。本研究中，30%乙醇灌胃對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成了損傷。一次性飲入過量乙醇，能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)由興奮轉(zhuǎn)為抑制狀態(tài)，首先作用于大腦皮層，然后累及皮層下中樞和小腦，導(dǎo)致記憶力下降[25]。乙醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制比較復(fù)雜，其中之一是對膽堿能系統(tǒng)的影響[26]。而中樞膽堿能系統(tǒng)則與學(xué)習(xí)記憶密相關(guān)，膽堿能系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh），其釋放量隨著學(xué)習(xí)與記憶、探究行為等認(rèn)知活動的發(fā)生而隨之改變。ChAT對ACh的合成起著催化作用，而AChE則參與腦內(nèi)ACh的分解，使神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用終止，保證神經(jīng)傳遞正常。在大腦內(nèi)，ChAT和AChE共同維持著ACh的動態(tài)平衡[27]。由于ACh性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易水解，故通過檢測ChAT和AChE的活性間接來反映ACh的含量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇組ChAT活性降低，AChE活性升高，即ACh分解加快而合成減少，AChE總體水平降低，學(xué)習(xí)記憶受損。從行為上看，飼喂雄海馬的小鼠其學(xué)習(xí)記憶有所改善，潛伏期增加，錯誤數(shù)（次）減少；而飼喂雌海馬的小鼠，學(xué)習(xí)記憶能力并未改善。生化指標(biāo)則顯示，飼喂雄海馬的小鼠其腦內(nèi)AChE活性與乙醇組相比顯著降低，ChAT活性則無明顯變化，提示雄海馬對學(xué)習(xí)記憶的改善可能是通過抑制ACh分解而非加速其合成，此外在不同記憶損傷模型小鼠中，利用不同中藥如夏天無和刺五加，均顯示可通過抑制AChE來達(dá)到記憶改善的效果[28-29]；由于雌海馬未能改善乙醇造成的學(xué)習(xí)記憶損傷，所以與乙醇組相比，飼喂雌海馬的小鼠其腦內(nèi)ChAT和AChE活性也無改變。

本研究存在以下兩點(diǎn)不足：1. 評價抗疲勞經(jīng)典藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)有轉(zhuǎn)棒疲勞和負(fù)重游泳，評價記憶改善的有跳臺，避暗及水迷宮實(shí)驗(yàn)。目前本實(shí)驗(yàn)只各采用了其中一種方法。2. 實(shí)驗(yàn)中所用海馬為粉末粗材料，應(yīng)該找出其中的有效成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。接下來筆者及研究團(tuán)隊(duì)將對雌、雄海馬成分進(jìn)行更深入的分析，優(yōu)化海馬提取物，完善實(shí)驗(yàn)方案，為更準(zhǔn)確、更好地利用海馬資源提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

雄海馬可以通過降低體內(nèi)乳酸含量，增強(qiáng)小鼠的抗疲勞能力；通過抑制乙酰膽堿酯酶，改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；而單獨(dú)的雌海馬則沒有上述功能。雄海馬在抗疲勞和改善記憶方面的效果顯著而雌海馬無效。

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Comparison Between male and Female Sea Horse in the Anti-fatigue and Memory Improvement

TANG Hai-ting, ZHANG Cai, ZHANG Yong-ping, YANG Long-en, GU Min-qing, LI Ya-juan, YAN Ling, CAI Song

（,,,524000,;,,518120,）

【】To compare the different effects of male and female sea horse in the anti-fatigue and memory improvement in mice.【】The rotarod test was used to test anti-fatigue ability in mice and they were divided into three groups. One group was fed with normal fodder, and the other two groups were fed with 0.22% female and male sea horse for 6 weeks respectively. Step down test was used to test the ability of learning and memory in mice, and they were divided into four groups. The control group and the model group were fed with normal fodder, and the other two groups were fed with 0.22% female and male sea horse for 6 weeks respectively. To induce memory impairment, 30% ethanol was applied through intragastric administration in the model, female and male sea horse groups.【】In the anti-fatigue experiment, male sea horse significantly prolonged the time that the mice remained on the rotating rod（< 0.05）and decreased the serum lactic acid concentration significantly（< 0.05）,but the female sea horse did not show the same results. Comparing with the control group in the memory impairment experiment, the latency dropped significantly in the model group（< 0.01）, and the number of errors was increased significantly (< 0.01). Comparing with the model group, the latency was significantly increased（< 0.05）and the number of errors was significantly reduced（< 0.05）in the male sea horse group. The activity of acetylcholinesterase in the brain tissue was significantly lower too（< 0.05）. There was no difference between the female sea horse group and the model group.【】The effect of male sea horse is significantly better than that of female sea horse in enhancing the anti-fatigue ability and improving memory.

female and male sea horse; anti-fatigue; memory improvement.

Q954.4

A

1673-9159（2019）03-0103-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.014

2019-01-24

深圳萬騏海洋生物技術(shù)有限公司合作項(xiàng)目“海馬高值化綜合利用研究”; 湛江市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目“腦健康相關(guān)海洋藥物與營養(yǎng)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”

唐海婷（1994—），女，碩士研究生，主要從事精神神經(jīng)免疫學(xué)和海洋生物活性物質(zhì)研究。E-mail:2637573867@qq.com

宋采，女，教授，研究方向?yàn)榫裆窠?jīng)免疫學(xué)和海洋活性物質(zhì)藥理學(xué)。E-mail:cai.song@dal.ca

唐海婷，張才，張永平，等. 雌、雄海馬抗疲勞和改善記憶障礙比較[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2019，39（3）：103-108.

（責(zé)任編輯：劉朏）