大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后白藜蘆醇對損傷睪丸的保護和修復的研究

蔡國梅張華鋒. 山東省濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院腎內(nèi)科（青州 262500）；2. 山東省青州市人民醫(yī)院泌尿外科

大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后白藜蘆醇對損傷睪丸的保護和修復的研究

蔡國梅1張華鋒2*
1. 山東省濰坊醫(yī)學院附屬益都中心醫(yī)院腎內(nèi)科（青州 262500）；2. 山東省青州市人民醫(yī)院泌尿外科

摘要目的 探討不同白藜蘆醇（resveratrol，Res）劑量對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)損傷復位后的超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（CAT），丙二醛（MDA），白介素-6（IL-6）及睪丸腦紅蛋白 （neuroglobin, NGB）的影響。方法 60只成年雄性SD大鼠隨機分為扭轉(zhuǎn)復位組為A組；白藜蘆醇低劑量（25mg/kg）為B組；白藜蘆醇高劑量（50mg/kg）為C組；對照組為（D）組。按Turner法建立單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)模型。每組根據(jù)設定處理方式的不同分別進行處理。扭轉(zhuǎn)復位術后48h，采集左側(cè)睪丸并進行指標（SOD、CAT、MDA及IL-6含量）檢測；采用原位缺口末端標記（TUNEL）檢測細胞凋亡指數(shù)（AI）；HE染色及Johnsen評分評估睪丸組織病理改變；電鏡觀察睪丸組織內(nèi)生精小管及生精細胞超微改變；RT-PCR法檢測睪丸組織中NGB mRNA的表達情況。結(jié)果 睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后，MDA為（2.890±6.51）mg/ L，IL-6為（31.221±7.02）μg/ L 明顯升高，SOD為（240.985±8.19）mg/ L，CAT為（1.006 ±0.31）mg/ L及NGB mRNA為（0.35±0.01）明顯減少，睪丸組織細胞大量凋亡。應用白藜蘆醇后能改善上述改變，且隨劑量增大，炎癥改變明顯減輕；腦紅蛋白基因表達量明顯增高，其中A組；B組；C組；D組NGB mRNA含量分別為0.35±0.01; 0.42±0.13; 0.81±0.19; 0.55±0.41，且組間兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 白藜蘆醇對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)具有保護作用，隨劑量增中，其保護作用更加顯著，同時具有提高抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化及降低血清炎癥因子能力，其機制可能是通過誘導NGB mRNA表達而實現(xiàn)。

關鍵詞精索扭轉(zhuǎn); 白藜蘆醇

睪丸扭轉(zhuǎn)多見于青少年和新生兒期，是導致睪丸疾病的急腹癥之一，新生兒期睪丸扭轉(zhuǎn)發(fā)生率為/7 500[1]。研究表明睪丸扭轉(zhuǎn)如果未及時復位時，將導致睪丸的生精上皮細胞凋亡，睪丸生精細胞及發(fā)育表達相關蛋白受到破壞，嚴重導致不育[2, 3]。睪丸扭轉(zhuǎn)后引起組織細胞形態(tài)學及免疫功能改變，同時生精細胞受損，細胞基因轉(zhuǎn)錄及合成障礙。白藜蘆醇（resveratrol, Res）具有天然的抗炎、抗氧化劑免疫調(diào)節(jié)功能，改善組織微環(huán)境，以往研究表明[4, 5]其在缺血疾病時有保護作用。本實驗通過建立睪丸扭轉(zhuǎn)模型，探討不同劑量白藜蘆醇對大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)后睪丸腦紅蛋白基因（NGB mRNA）表達情況及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）的影響和可能發(fā)病機制。

資料與方法

一、藥物與試劑

白藜蘆醇粉劑（陜西慧科生物有限公司）；細胞凋亡檢測（TUNEL）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；和 PCR 試劑盒（購自Fermentas公司）；丙二醛、超氧化物岐化酶、過氧化物酶及白介素-6測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

二、實驗動物分組

60只清潔健康成年雄性大鼠，體重280g～350g，由濰坊醫(yī)學院實驗動物中心提供，隨機分為扭轉(zhuǎn)復位組為A組；白藜蘆醇低劑量（25mg/kg）為B組；白藜蘆醇高劑量（50mg/kg）為C組；對照組為D組，每組5只。

三、模型制作方法

睪丸扭轉(zhuǎn)模型的建立采用Turner法[6]戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，下腹正中小切口，游離左側(cè)睪丸，切除睪丸引帶，分離周圍筋膜至附睪頭，所有標本根據(jù)實驗設計要求分為4組。扭轉(zhuǎn)復位組（A組）：左側(cè)陰囊切開后，繞精索順時針扭轉(zhuǎn)睪丸720°，肉膜白膜縫合固定防止自發(fā)復位，陰囊縫合，2h后，再次切開左側(cè)陰囊，將扭轉(zhuǎn)的睪丸復位固定，縫合陰囊。白藜蘆醇低劑量（B組）：在A組的基礎上于復位前20min，通過陰莖背靜脈注射白藜蘆醇（25mg/kg）；白藜蘆醇高劑量（C組）：在A組的基礎上于復位前20min，通過陰莖背靜脈注射白藜蘆醇（50mg/kg）；對照組（D組）：正常大鼠，體質(zhì)量為280g～350g。游離暴露睪丸，但不予扭轉(zhuǎn)，陰囊縫合關閉。術后均標準食譜喂養(yǎng)，48h后取扭轉(zhuǎn)睪丸，分別制作組織勻漿和石蠟切片。

四、檢測指標

（一）SOD、CAT、MDA和 IL-6含量檢測

取各組睪丸組織0.3g，用勻漿介質(zhì)制成15%的組織勻漿，光法檢測CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，酶聯(lián)免疫法測定IL-6血清含量，操作均嚴格按說明書進行。

（二）睪丸細胞凋亡率（AI）檢測

應用原位缺口末端標記(TUNEL)法，按照試劑盒說明書進行操作。每張切片均在高倍鏡（400倍）視野下隨機選取5個視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)目及總細胞數(shù)目。以5個視野的平均值代表每只大鼠睪丸組織細胞的凋亡率。

（三）標本的病理學觀察

取睪丸組織，以40g/L多聚甲醛固定24h后作常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察睪丸組織的病理改變，電鏡觀察睪丸組織內(nèi)生精小管及生精細胞超微改變。采用Johnsen評分判斷睪丸病理損傷程度[7]。

（四） RT-PCR法檢測各組睪丸組織NGB mRNA表達情況

PCR擴增引物（NGB mRNA）序列：上游引物序列為:5'-GGGCTCCTCCTGTCACCTTAC-3'，下游引物5'-TCCCACTCTATTTGCTCTCGC-3'（reverse）；內(nèi)參GAPDH引物序列，上游引物5'-GCCAAGGTC ATCCATGACAACTTTGG-3'，下游引物5'-GCCTG CTTCACCACCTTCTTGATGTC-3'，收集各組睪丸組織，提取組織中總RNA，參照Revert Aid TM First Strand Cdna Synthesis說明書，進行逆轉(zhuǎn)錄反應，操作嚴格按照試劑盒說明要求進行。所得數(shù)據(jù)分析均由FTC-2000分析軟件自動進行，所得靶基因相對含量=2-（Ct靶基因-CtGAPDH）X103，其中GAPDH為內(nèi)參照。

五、統(tǒng)計學處理

運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、睪丸組織中SOD、CATT、MMDDAA和 IL-6含量的變化

各組睪丸中SOD、CAT、MDA和 IL-6含量的變化結(jié)果顯示：睪丸扭轉(zhuǎn)組MDA和 IL-6含量明顯高于其他3組，SOD、CAT含量低于其他三組，組間比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；藥物白藜蘆醇后MDA 和 IL-6含量有所降低，其中以高劑量為主，藥物組與其他組比較有統(tǒng)計學意義；低劑量組與高劑量組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明白藜蘆醇能減輕扭轉(zhuǎn)睪丸組織的炎癥反應程度，并以高劑量白藜蘆醇C組為著，見表1。

二、各組睪丸組織細胞凋亡原位檢測

扭轉(zhuǎn)復位組（A組）大鼠睪丸生精細胞排列紊亂，生精細胞脫落明顯、胞漿濃縮，生殖細胞凋亡陽性細胞數(shù)量明顯增加。在對照組（D組）睪丸生精上皮未見凋亡細胞。白藜蘆醇藥物組生精細胞脫落及生殖細胞凋亡率明降低，且隨白藜蘆醇藥物劑量的增加，凋亡率降低程度更為明顯，以C組為著，與扭轉(zhuǎn)復位組及對照組比較，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）表2。

三、大鼠睪丸組織的病理改變

扭轉(zhuǎn)復位組（A組）（圖1A1A）睪丸生精上皮嚴重損傷，僅見有少量精母細胞，呈唯Sertoli細胞表現(xiàn)，間質(zhì)重度水腫、充血，可見有大量中性粒細胞。白藜蘆醇低劑量（B組）（圖1B1B）可見生精上皮脫落，精子數(shù)量減少，組織中度充血、水腫。白藜蘆醇高劑量（C組）（圖1C1C）生精上皮未見明顯紊亂，可見大量精子，間質(zhì)輕度水腫，見少量中性粒細胞。對照組（D組）（圖1D1D）睪丸生精上皮結(jié)構正常，未見明顯損傷。白藜蘆醇高劑量C組Johnsen評分與其他組Johnsen評分比較明顯高，見表2。

表1 各組大鼠睪丸組織中CAT、 SOD 、MDA、IL-6含量變化

表2 各組大鼠睪丸組織細胞凋亡率（AIAI）及Johnsenhnsen評分比較

圖1 大鼠睪丸組織的病理改變（HE×400）

四、各組大鼠睪丸組織超微結(jié)構變化

電鏡下扭轉(zhuǎn)組（A組）（圖2A2A）精原細胞核膜不規(guī)整，未進入分裂前狀態(tài)，細胞間隙見大小不等的脂滴。對照組（D組）（圖2D2D）睪丸內(nèi)見正常形態(tài)的精子細胞，且精子發(fā)生正常。白藜蘆醇藥物組大鼠睪丸內(nèi)精子細胞核圓，胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，尾部線粒體較均勻，脂滴減少明顯，微管結(jié)構及赤道板漸變清晰，以高劑量C組為著（圖2B2B, 圖2C2C）。

圖2 大鼠睪丸組織超微改變

五、RT-PCRT-PCR法檢測睪丸組織中NGB mRNA mRNA的表達變化

各組睪丸組織扭轉(zhuǎn)組及藥物組，NGB mRNA （287bp）相應片段大小的位置出現(xiàn)條帶，NGB mRNA的條帶強度均比內(nèi)參GAPDH條帶的強度明顯要弱，與A組條帶相比，其他各組條帶明顯增強，其C組亮度明顯強于D組， A組；B組；C組；D組表達含量分別（0. 35±0.01; 0. 42±0.13; 0. 81±0.19; 0.55± 0.41）兩組間比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中白藜蘆醇藥物后大鼠睪丸組織中NGB mRNA表達含量較明顯上調(diào),說明大鼠睪丸組織中NGB mRNA表達含量較扭轉(zhuǎn)組明顯升高，見圖3。

圖3 大鼠睪丸組織NGBmRNA含量表達情況

討 論

睪丸扭轉(zhuǎn)實質(zhì)引起組織缺血缺氧性損傷，發(fā)生病理生理性改變，此過程引起睪丸生精上皮系統(tǒng)發(fā)生系列變化，釋放大量細胞因子和其他炎癥介質(zhì)，最終引起生精細胞凋亡[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇是一類多酚類化合物，它具有抗氧化、抗炎，保護心腦血管、免疫調(diào)節(jié)作用，其在腸缺血缺氧損傷和、應激性胃潰瘍中具有保護作用，提高抗氧化功能及抑制上皮細胞凋亡作用[9, 10]。本實驗采用TUNEL法檢測各組大鼠睪丸生精上皮細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：扭轉(zhuǎn)組睪丸細胞凋亡指數(shù)顯著高于其他組，說明睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后使大鼠睪丸生精上皮凋亡明顯增加，在大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)后，給予白藜蘆醇治療能減輕生精上皮細胞凋亡程度，同時顯示隨著其劑量增加，其抑制細胞凋亡程度明顯增強，Johnsen評分也顯著升高，表明白藜蘆醇對睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后的生精細胞的保護可能與抑制細胞凋亡有關，且隨劑量增加，其凋亡率降低程度更為明顯。

研究表明腦紅蛋白（neuroglobin, NGB）主要在腦缺血疾病及內(nèi)分泌疾病中有保護作用，認為它可能通過攜氧、貯氧和氧感受器功能，NADH 氧化酶作用，以及ROS 和NO基團清道夫等功能，對缺血缺氧性損傷起到改善或保護作用[11-13]。正常情況下機體氧自由基的產(chǎn)生、利用和清除之間處于一種動態(tài)平衡。但在睪丸缺血再損傷中，使睪丸處于氧化應激狀態(tài)，氧自由基急劇增多，氧自由基對細胞膜的損傷可引起生物膜及脂質(zhì)過氧化反應，結(jié)合了炎癥介質(zhì)的釋放，最終導致MDA及 IL-6含量增加，組織細胞損傷，生精細胞凋亡明顯。

本研究通過建立大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)模型后，進一步探討了白藜蘆醇對大鼠扭轉(zhuǎn)后NGB mRNA基因表達及SOD、CAT、MDA及IL-6的表達特點，應用白藜蘆醇藥物后結(jié)果顯示，抗氧化酶SOD、CAT活性明顯高于扭轉(zhuǎn)組，MDA、IL-6含量明顯低于扭轉(zhuǎn)組，兩組間比較均有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。睪丸扭轉(zhuǎn)后抗氧化酶系統(tǒng)已遭破壞，從而啟動了凋亡程序。觀察了組織病理及形態(tài)學改變，扭轉(zhuǎn)復位組，被膜血管擴張明顯，大量中性粒細胞浸潤，曲細精管結(jié)構紊亂、變性壞死增多，此與文獻報道基本一致[14, 15]。本研究應用白藜蘆醇后睪丸生精小管結(jié)構較為完整，生精細胞層次稍有紊亂，尾部線粒體較均勻，脂滴減少明顯，微管結(jié)構及赤道板漸變清晰，以高劑量C組為著。電鏡下扭轉(zhuǎn)組可見大量脂滴和精原細胞核膜不規(guī)整現(xiàn)象，應用白藜蘆醇后脂滴減少明顯，且可見精子細胞核膜規(guī)整、核圓、胞質(zhì)內(nèi)線粒體。RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)，應用白藜蘆醇后大鼠睪丸組織中NGB mRNA基因表達條帶亮度明顯增強，說明白藜蘆醇提高睪丸組織中腦紅蛋白基因（NGB mRNA）表達含量，高劑量白藜蘆醇組NGB mRNA含量最高，提示可能在睪丸扭轉(zhuǎn)后抗缺氧缺血損傷方面有一定的積極意義。

總之，本研究應用白藜蘆醇后大鼠睪丸組織SOD、CAT活性明顯增高， MDA、IL-6含量明顯下降，睪丸腦紅蛋白 （neuroglobin，NGB）含量表達明顯增強，以高劑量組為最顯著。當然本研究存在缺陷和不足，如無對睪丸扭轉(zhuǎn)復位的不同時間尋找不可逆損傷關鍵時間點，并給予白藜蘆醇干預治療。目前Res對睪丸扭轉(zhuǎn)后NGB mRNA表達與抗氧化酶系統(tǒng)的因果關系尚未明確，本研究顯示大鼠單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)后, 應用白藜蘆醇對睪丸組織功能具有改善或保護作用，同時提高了抗氧化酶系統(tǒng)的抗氧化能力以及降低了血清炎癥因子能力，推測可能是通過誘導NGB mRNA基因表達而實現(xiàn)，但如何誘導及調(diào)控等問題有待搜集大量樣本進一步深入研究探討。

參 考 文 獻

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（2014-12-05收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.006

中圖分類號R 697.24

*通訊作者, E-mail : zhanghuafeng09@126.com

Proctective effects and repair discussion of resveratrol on testicular torsion in rats

Cai Guomei1, Zhang Huafeng2*
1. Department of Renal Medicine , Yidu Central Hospital, Affi liated to Weifang Medical School, Qingzhou 262500, China; 2. Department of Urology Surgery, Qingzhou People's Hospital
Corresponding author: Zhang Huafeng, E-mail : zhanghuafeng09@126.com

AbstractObjective To analyze the expression profi les of SOD, CAT, MDA, IL-6, neuroglobin in testis tissues of rat testicular torsion under resveratrol intervention, and explore its protective effecton. Methodsthods Sixty SD rats were randomly divided into four groups including the torsion (A) group, low dose resveratrol (25mg/kg B) group, high dose resveratrol (50mg/kg C) group and sham(D) group.After 48 hours treatment, the rats were killed and their left testis were collecetd and the levels of superoxide dismutase(SOD),the activity of catalase(CAT) and level of malonic Diethylaldehyde (MDA), interleukin-6(IL-6) were detected; Germ cell apoptosis index(AI) was measured by TUNEL; The histological changes were observed by hight microscope and Johnsen score. The NGB mRNA expression was detected by reversetranscription PCR. Resultssults For the rats in torsion injury group, the cells apoptosis and MDA[ (2.890±6.51) mg/ L], IL-6 [ (31.221±7.02) μg/ L] levels were remarkably increased, and SOD[ (240.985±8.19) mg/ L], CAT[ (1.006±0.31) mg/ L] andNGB mRNA (0.35±0.01) levels were decreased. For the rats in the resveratrol treatment group, the relief of infl ammatory degree and increase of NGB mRNA had a positve correlation with the concentration of resveratrol.The express of NGB had signifi cant difference among these four groups(groupA 0.35±0.01,group B 0.42±0.13,group C 0.81±0.19, group D 0.55±0.41, the difference is signifi cant in each two groups, P＜0.05). Conclusionusion Resveratrol has protective effect on testis in adult rats testieulus torsion and reduce the germ cell apoptosis and repress the generation of oxygen-derived free radicals.This effect may be achieved through an induced expression of NGB mRNA.

Key wordsords spermatic cord torsion; resveratrol