六神曲酶活性研究進(jìn)展△

范亞楠，陳彥琳，杜杰，鐘榮榮，孫曉叢，周旭，王奕博

中國(guó)中藥有限公司，北京 100195

六神曲又名神曲、六曲，最早收載于《藥性論》[1]，為面粉、麥麩、苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣蓼及蒼耳草混合后經(jīng)發(fā)酵而成的曲劑[2]，其富含維生素B 復(fù)合體、消化酶、揮發(fā)油、麥角固醇、苷類和黃酮類等活性物質(zhì)。六神曲主要具有健脾和胃、消食調(diào)中等功效[3]，臨床多用于飲食停滯、脾胃虛弱、小兒積食及胸痞腹脹的治療，應(yīng)用廣泛。

按照現(xiàn)代微生物學(xué)的觀點(diǎn)，六神曲的發(fā)酵本質(zhì)上是基質(zhì)和環(huán)境中攜帶的微生物在適宜環(huán)境下進(jìn)行的生物代謝。根據(jù)以往研究結(jié)果，這些微生物主要為酵母菌、真菌、細(xì)菌。微生物為了分解基質(zhì)，生成自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生木質(zhì)素酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪以及蛋白酶等多種胞內(nèi)酶系和胞外酶系。這些酶類可以將基質(zhì)的成分分解轉(zhuǎn)化，形成新的成分。六神曲原料并沒有消食的功效，而在發(fā)酵后具備了健脾消食的作用，說明藥效作用是由發(fā)酵產(chǎn)生，藥效物質(zhì)為微生物在代謝過程中產(chǎn)生的酶或者代謝產(chǎn)物，這就是六神曲發(fā)酵炮制的理論依據(jù)[4]。六神曲中主要含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、糖化酶、麥芽低聚糖酶[5]等，可將六神曲基質(zhì)中的淀粉、蛋白質(zhì)分解為單糖、低聚糖、氨基酸、小肽，微生物進(jìn)行物質(zhì)代謝產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈脂肪酸類成分也是協(xié)助胃腸道行使正常功能，預(yù)防胃炎和胃腸道潰瘍的主要成分[6-11]。由于酶的活性大小決定代謝物產(chǎn)生的多少，因此，對(duì)于酶活性的監(jiān)測(cè)可有效評(píng)價(jià)發(fā)酵的程度。本文主要從酶活性檢測(cè)方法及酶活性研究方法對(duì)六神曲的研究進(jìn)行歸納，旨在為六神曲的深入研究及開發(fā)利用提供參考。

1 六神曲酶活性概況

1.1 淀粉酶

淀粉酶是分解淀粉糖苷鍵一類酶的總稱，有α-淀粉酶、γ-淀粉酶、麥芽低聚糖酶等多種酶。

1.1.1α-淀粉酶α-淀粉酶主要作用是水解淀粉分子鏈的α-1，4-葡萄糖苷鍵，切斷成寡糖、短鏈糊精及少量葡萄糖和麥芽糖，使淀粉黏度迅速下降，從而達(dá)到“液化”目的。因此，α-淀粉酶又稱液化酶，但其不能作用于支鏈淀粉。產(chǎn)生此酶的微生物主要有細(xì)菌、真菌及基因工程菌等[12]。細(xì)菌包括枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌，真菌主要是青霉菌、曲霉菌，青霉菌大多為黃青霉，曲霉菌主要包括米曲霉、黑曲霉、煙曲霉。

淀粉酶的測(cè)定方法在實(shí)際應(yīng)用中可大致分為2 種，一種方法原理是利用二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該反應(yīng)產(chǎn)物在高溫條件下顯現(xiàn)棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)其顏色深淺與還原糖含量成正比，可以用比色法測(cè)定還原糖含量，如DNS 測(cè)定法；另一種方法是利用直鏈淀粉和支鏈淀粉遇碘顯色不同，α-淀粉酶的水解活性液中直鏈淀粉和碘反應(yīng)形成藍(lán)色絡(luò)合物，支鏈淀粉遇碘則呈現(xiàn)紫紅色。在直鏈淀粉聚合度降低到一定程度時(shí)，其與碘的復(fù)合物呈紅棕色。在酶底物反應(yīng)終止后，可以通過測(cè)定其吸光度確定α-淀粉酶水解淀粉的程度，如碘法。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，最早的六神曲淀粉酶活性研究始于1977年，檢測(cè)方法為次亞碘酸定糖法[13]；2004 年，高慧等[14]首次運(yùn)用碘-淀粉比色法測(cè)定淀粉酶活性；2012年，王海洋等[15]引入DNS 測(cè)定法測(cè)定淀粉酶活性；碘-淀粉比色法及DNS測(cè)定法一直延續(xù)至今。

1.1.2γ-淀粉酶γ-淀粉酶又稱糖化酶。γ-淀粉酶能從淀粉的非還原端水解支鏈淀粉和長(zhǎng)鏈淀粉，水解產(chǎn)物為葡萄糖。產(chǎn)生此酶的微生物為蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、假單胞菌等[16]。

γ-淀粉酶測(cè)定方法近年來研究的也較多[17-19]，依據(jù)其作用原理大致可分成3 類：測(cè)定淀粉水解后的還原產(chǎn)物；測(cè)定淀粉的消耗量；色素測(cè)定法。其中前2 種方法與α-淀粉酶測(cè)定方法原理基本一致，但在實(shí)際應(yīng)用中，γ-淀粉酶的測(cè)定方法在六神曲中使用較廣泛的是DNS比色法，該方法反應(yīng)較靈敏。

1.1.3 麥芽低聚糖酶 麥芽低聚糖酶是淀粉酶的一種，其酶解產(chǎn)物麥芽低聚糖具有抑制腸道有害菌生長(zhǎng)的作用。產(chǎn)生此酶的微生物為嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等[20]。

目前，麥芽低聚糖酶活力的測(cè)定尚無國(guó)家部頒標(biāo)準(zhǔn)，中外文獻(xiàn)資料也未見報(bào)道。劉建軍等[21]依據(jù)部頒標(biāo)準(zhǔn)γ-淀粉酶的測(cè)定方法，制定了麥芽低聚糖酶活力的測(cè)定方法。

1.2 蛋白酶

蛋白酶是六神曲中主要消化酶之一，其可以切斷蛋白質(zhì)分子的肽鍵，使其變成小分子的氨基酸和多肽。產(chǎn)生此酶的微生物主要為枯草芽孢桿菌及曲霉等。

蛋白酶的測(cè)定方法多采用福林酚法[22]，福林酚法又稱福林法。福林酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物），由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物在堿性條件下被還原成藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物）。

1.3 其他

1.3.1 纖維素酶 纖維素酶（CMC）是一種復(fù)合酶，是催化β-1，4-葡萄糖苷鍵水解的一種酶，經(jīng)酶類共同作用，將纖維素降解為葡萄糖和纖維二糖。其主要由葡聚糖內(nèi)切酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶3種主要成分組成，濾紙酶（FPA）活力測(cè)定法是一種通用的較為經(jīng)典的測(cè)定纖維素酶綜合活力的方法[23-25]，其反映了3 類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱FPA 活性。產(chǎn)生纖維素酶的主要是根霉、黑曲霉和木霉等。

FPA 和CMC 的酶活力接近，這可能與藥效成分的抽出和植物破壁有關(guān)[26]。測(cè)定方法為分別以1% CMC 溶液和whatman NO.1 濾紙為底物，采用DNS比色法測(cè)定CMC和FPA的活力。

1.3.2 脂肪酶 脂肪酶可以催化油脂分解為甘油、脂肪酸及甘油單脂或二脂，且能分解或合成高級(jí)脂肪酸，并具有多種催化能力，可催化不溶性酯類的醇解、水解、轉(zhuǎn)酯化、酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)。產(chǎn)生此酶的主要是類酵母、假絲酵母和米根霉等。

脂肪酶活測(cè)定方法為以16.5 mmol·L-1對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）溶液為底物，采用pNPP 法測(cè)定脂肪酶活力[27]。

2 六神曲酶活性研究進(jìn)展

2.1 用于比較六神曲不同炮制品差異

有研究者采用碘量法對(duì)自制六神曲樣品進(jìn)行淀粉酶活力測(cè)定，結(jié)果表明，六神曲生品中的淀粉酶活力比炮制品要高，而炒后蛋白酶活力顯著升高；在改善胃腸動(dòng)力藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方面，生品、制品均能提升病理模型小鼠的小腸推進(jìn)功能，且生品優(yōu)于制品[3]。

2.2 用于優(yōu)化六神曲工藝

2.2.1 用于優(yōu)化六神曲處方 劉騰飛等[28]采用DNS法測(cè)定糖化酶及淀粉酶含量，綜合糖化酶、淀粉酶及蛋白酶指標(biāo)優(yōu)選神曲配料比為麩面比70∶30，碳氮比100∶2。高慧等[14]按碘-淀粉比色法對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制六神曲中淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同面粉、麥麩配比的樣品淀粉酶活力有差異，蛋白酶活力、薄層色譜未見顯著差異?？紤]到曲料的黏性、拌曲的難易程度及原料的經(jīng)濟(jì)性，選面粉∶麥麩=25∶75為最佳配比。此結(jié)果與劉騰飛等[28]研究的麩面比結(jié)果幾乎吻合。王麗芳等[29]采用相同方法測(cè)定淀粉酶活性，結(jié)果顯示，無論是在28 ℃還是33 ℃下發(fā)酵，鮮品組淀粉酶及脂肪酶活力峰值都明顯高于干品組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，鮮品煎汁組略高于鮮品榨汁組，六神曲用鮮品組方入藥優(yōu)于干品組。

除此之外，戚岑聰?shù)萚30]在六神曲發(fā)酵過程的質(zhì)量監(jiān)測(cè)中運(yùn)用近紅外光譜分析技術(shù)，結(jié)果表明，運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)對(duì)蛋白酶、淀粉酶活力進(jìn)行定量分析，和傳統(tǒng)的分析方法所得結(jié)果之間具有較好的相關(guān)性。而且，建立的模型在全面粉發(fā)酵組與麥麩面粉比例1∶1 發(fā)酵組中均有較好的適用性，可以考慮將模型進(jìn)一步推廣。

2.2.2 用于優(yōu)化六神曲發(fā)酵工藝 徐云等[26]運(yùn)用DNS 比色法發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的消化酶存在一定變化規(guī)律：纖維素酶、淀粉酶及脂肪酶的活力在發(fā)酵4 d時(shí)達(dá)到峰值，糖化酶活力在發(fā)酵第三天時(shí)達(dá)到峰值，而后4 種酶活力都有下降的趨勢(shì)并逐漸趨于平穩(wěn)；而蛋白酶活力在發(fā)酵前4 d 并沒有顯著變化，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白酶活力顯著升高。因此，最終確定六神曲的發(fā)酵工藝時(shí)間為4～6 d。張紅玲等[31]采用碘-淀粉比色法研究了由四川輔正藥業(yè)公司提供的8批六神曲自制發(fā)酵品（發(fā)酵天數(shù)為8 d，每天取樣），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖化酶及淀粉酶活力在4 d達(dá)到最高值，而蛋白酶活力在第五天達(dá)到最高值，并選六神曲發(fā)酵第四天的樣品進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)有顯著影響，因此，六神曲最佳發(fā)酵時(shí)間為4 d 左右。劉騰飛等[32]采用DNS 比色法，按照《全國(guó)中藥炮制規(guī)范》的方法制備六神曲，考察在赤小豆加入量、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度單因素的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為赤小豆加入量2.6 g·（100 g）-1、發(fā)酵溫度為32 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d。王海洋等[15]按照《全國(guó)中藥炮制規(guī)范》制備六神曲，采用相同方法對(duì)淀粉酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度控制在30～37 ℃時(shí)，最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d；赤小豆的最佳處理方法為煮爛拌曲；青蒿、辣蓼、蒼耳草的最佳添加方式為以鮮品水煎液混合均勻后拌曲，發(fā)酵后六神曲的淀粉酶活力明顯高于市售的2 種六神曲樣品。劉曉瑜等[33]采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活力，綜合蛋白酶、淀粉酶的活力和高效液相色譜法（HPLC）特征圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六神曲最佳發(fā)酵的相對(duì)濕度為80%，中藥汁加入量為0.65 mL·g-1。

2.3 用于篩選六神曲發(fā)酵菌種

鄔吉野等[2]運(yùn)用碘-淀粉比色法檢測(cè)酶活性發(fā)現(xiàn)，六神曲原料中不含淀粉酶、蛋白酶，而黃曲霉純種發(fā)酵能顯著升高六神曲中2 種酶的酶活力。有研究者采用相同方法測(cè)定淀粉酶活性[34]，研究發(fā)現(xiàn)，毛霉菌可以提高按照傳統(tǒng)工藝制作的六神曲樣品中淀粉酶及蛋白酶活力，因此，認(rèn)為毛霉菌為進(jìn)行六神曲純種發(fā)酵的最優(yōu)菌種。程亦雄等[35]則采用福林法測(cè)定蛋白酶活力，發(fā)現(xiàn)分離得到的賽氏曲霉菌落質(zhì)地綠色呈絨毛狀，表面附有黃色滲出物，在發(fā)酵過程伴有輕微的酸性氣味散出，且產(chǎn)蛋白酶的活性明顯優(yōu)于淀粉酶活性，因此，認(rèn)為賽氏曲霉菌落可作為優(yōu)選菌種進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.4 用于比較六神曲不同工藝差異

六神曲的制作工藝各地藥品標(biāo)準(zhǔn)要求不一，其差異主要體現(xiàn)在原料配比與生產(chǎn)條件上。王云庭等[5]首次以麥芽低聚糖酶活力為考察指標(biāo)，比較不同產(chǎn)地六神曲樣品中生品、制品的麥芽低聚糖酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六神曲不同產(chǎn)地的麥芽低聚糖酶活力有顯著差異。其中，生品六神曲酶活力最高的為廣西，最低的為四川，同一產(chǎn)地的六神曲樣品生品酶活力大于炮制品。張鵬等[36]收集了6個(gè)不同產(chǎn)地六神曲市售樣品，采用碘-淀粉比色法發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地六神曲樣品淀粉酶活力差異顯著，為200～500 U，范圍跨度較大。

3 展望

六神曲是臨床常用中藥飲片，但仍未被《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版收載。部頒標(biāo)準(zhǔn)也只收載了其組方配比及制作方式，同時(shí)僅憑外觀和經(jīng)驗(yàn)來評(píng)價(jià)質(zhì)量。經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，六神曲的生產(chǎn)來源不盡相同，許多廠家未經(jīng)衛(wèi)生部門的允許擅自生產(chǎn)，并且六神曲質(zhì)量評(píng)價(jià)體系尚不完善，導(dǎo)致市售六神曲樣品的質(zhì)量差異較大，市場(chǎng)上偽劣產(chǎn)品較多。目前，六神曲的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要為性狀、鑒別、檢查、浸出物、指紋圖譜等，但由于其藥材來源復(fù)雜及工藝的特殊性，建議應(yīng)該引入消化酶作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)六神曲中蛋白酶及淀粉酶研究較多，但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，已確定優(yōu)勢(shì)菌種為扣囊和米根霉，其中米根霉可產(chǎn)生纖維素酶和脂肪酶，這2 個(gè)指標(biāo)在發(fā)酵工藝中還沒被監(jiān)測(cè)過。因此，日后將重點(diǎn)研究纖維素酶和脂肪酶活性，同時(shí)建立測(cè)定方法，以確保實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可靠，從而進(jìn)一步控制和評(píng)價(jià)六神曲的質(zhì)量，為其臨床用藥安全有效提供參考。