沉香屬植物組培快繁研究進(jìn)展△

張燕，孟慧，呂菲菲，魏建和，楊云*，李浩凌，陳波，黃良明

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 ?？?570311

沉香是來自沉香屬（Aquilaria）植物受傷后所形成的含樹脂的木材，共有21 個(gè)種[1]，主要分布在亞洲，西起印度北部，東到巴布亞新幾內(nèi)亞，北至中國北回歸線附近，南達(dá)印度尼西亞島嶼。沉香屬所有植物均可產(chǎn)沉香。白木香A.sinensis（Lour.）Gilg 為我國特有種，是我國國產(chǎn)藥用沉香唯一的基原植物[2-3]，主要分布在海南、廣東、廣西、福建、云南和臺(tái)灣等地[4]。自古以來，沉香就被公認(rèn)為“香中之王”“藥中黃金”，也是我國道地的“十大南藥”品種之一，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效[5]。目前，沉香已成為海南島特色產(chǎn)業(yè)之一，在海南省2018 年印發(fā)的《海南省沉香產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》中將“香島”建設(shè)列入其中[6]，2020 年沉香也被海南省列為繼檳榔、椰子、橡膠后的“第四棵樹”重點(diǎn)發(fā)展。

沉香樹的繁育方式以種子繁育為主，而種子為頑拗型種子，極易喪失活力，難以保存[7]。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)質(zhì)植株通過種子繁育的后代無法保留其母本的遺傳特性，不利于優(yōu)良種質(zhì)資源的保存與延續(xù)[8-10]。目前，沉香種質(zhì)資源方面的研究較少，面臨流通中種子、種苗來源混亂、質(zhì)量參差不齊等問題[2-4]。因此，在獲取優(yōu)良沉香種質(zhì)資源的同時(shí)，想要獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗，從種子繁育技術(shù)角度存在技術(shù)瓶頸[11]。

大量研究表明，植物體外組織培養(yǎng)能夠有效地縮短繁殖周期，穩(wěn)定地保存優(yōu)良遺傳特性，并為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料。沉香屬所有種均為瀕危物種，采用組織培養(yǎng)方式擴(kuò)繁對(duì)保存種質(zhì)優(yōu)良特性、保護(hù)野生資源、維護(hù)生態(tài)平衡和促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義。利用優(yōu)良種質(zhì)組培苗推進(jìn)優(yōu)質(zhì)沉香樹種大規(guī)模種植，將人工栽培資源作為野生資源替代品，能夠在減少野生資源過度破壞的同時(shí)對(duì)生態(tài)環(huán)境的改善及物種多樣性的維護(hù)有極大的促進(jìn)作用。采用組織培養(yǎng)方式培育的優(yōu)良種苗能為中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和大健康產(chǎn)業(yè)提供優(yōu)質(zhì)充足的沉香原料，有效促進(jìn)我國沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了拓寬沉香樹育種途徑、改良其品質(zhì)，前人對(duì)沉香屬植物種質(zhì)的快速繁殖進(jìn)行了大量研究，并建立了沉香屬植物的再生體系。目前建立的沉香屬植物再生體系不夠完善，并沒有廣泛應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。本文綜述了沉香屬植物組織培養(yǎng)所采用的再生途徑，并對(duì)其不同培養(yǎng)方式下外植體選擇、植物生長調(diào)節(jié)劑的添加及組培過程中常見的問題進(jìn)行總結(jié)，希望能為沉香屬植物育種工作提供參考。

1 快速繁殖途徑

木本植物組織培養(yǎng)主要有器官發(fā)生途徑、體細(xì)胞胚發(fā)生途徑和腋芽生枝途徑3種[12]。在沉香屬植物組織培養(yǎng)中，器官發(fā)生途徑的應(yīng)用分為直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生2 種，即通過外植體直接誘導(dǎo)不定芽和先誘導(dǎo)外植體脫分化為愈傷組織，再通過愈傷組織分化出不定芽，進(jìn)而誘導(dǎo)生根形成再生植株。沉香屬21 個(gè)種的植物均能產(chǎn)生沉香，但研究者多圍繞著分布較廣或研究者所在區(qū)域生長的沉香物種進(jìn)行組培快繁研究。葉勤法等[13-14]通過直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生途徑均成功建立了中國白木香A.sinensis植株再生體系。相關(guān)研究通過直接器官發(fā)生途徑對(duì)沉香屬植物中國白木香、印度沉香A.agallocha、馬來沉香A.malaccensis、厚葉沉香A.crassna、密毛沉香A.hirta等進(jìn)行組織培養(yǎng)研究并獲得再生植株[8,15-20]。腋芽生枝途徑在沉香屬植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用體現(xiàn)在將萌發(fā)并伸長到一定長度腋芽用作幼嫩無菌材料，進(jìn)而通過直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽。林超[8]、張衛(wèi)華等[17]利用帶芽莖段為外植體誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，以新萌發(fā)的腋芽獲得叢生芽，并建立了植株再生體系。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑僅停留在懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，未見有學(xué)者通過懸浮細(xì)胞再生植株。有研究者對(duì)白木香懸浮細(xì)胞體系的建立進(jìn)行研究[21]，主要通過懸浮細(xì)胞培養(yǎng)研究沉香主要成分倍半萜類、色酮類化合物產(chǎn)生，但均未進(jìn)一步通過懸浮體系進(jìn)行植株再生研究[22-25]。目前，通過器官發(fā)生途徑進(jìn)行組織培養(yǎng)能夠產(chǎn)生再生植株，建立再生體系，但是該繁殖方式并沒有替代播種繁殖成為沉香種苗生產(chǎn)的主流方式。

2 組織培養(yǎng)影響因素

2.1 外植體選擇

植物細(xì)胞具有全能性，每個(gè)細(xì)胞都具有該植物體的全部遺傳特性，在一定條件下都能發(fā)育成完整植株。林木組織培養(yǎng)中，外植體的選擇影響植株再生途徑，并且在器官發(fā)生途徑中一定程度上決定采用的發(fā)生方式（直接器官發(fā)生或者間接器官發(fā)生）。孫海菁等[26]在弗吉尼亞櫟不定芽增殖及試管苗再生影響因子研究中選擇2～4 年生植株上未木質(zhì)化的枝條，切割成帶芽莖段作為外植體。劉盼盼等[27]在楓香優(yōu)良無性系組織培養(yǎng)研究中也選取楓香優(yōu)良單株當(dāng)年生的枝條做外植體，將枝條剪切為帶有1～2 個(gè)腋芽的莖段。曹昆等[28]則傾向于葉片作為外植體，認(rèn)為在一些瀕危樹種組織培養(yǎng)中，葉片由于其來源廣泛、可再生能力強(qiáng)，并且采摘葉片對(duì)母樹傷害小的優(yōu)勢(shì)可作為組織培養(yǎng)最佳的外植體材料。

沉香屬植物作為木本植物，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道，通常采用器官發(fā)生途徑再生植株，所選用的外植體有莖段、葉片、胚、胚軸、子葉、根等。木本植物不同外植體在相同條件下產(chǎn)生的愈傷組織能力和植株再生能力也不一樣[29]。沉香樹組織培養(yǎng)中帶腋芽的幼嫩莖段是最佳材料，能直接誘導(dǎo)腋芽和不定芽萌發(fā)，且莖段形成的愈傷組織能夠成功獲取不定芽，發(fā)育成苗[13,30]。莖段作為外植體有容易獲取、操作簡(jiǎn)便、誘導(dǎo)率高的特點(diǎn)。有研究者采用莖段作為外植體材料誘導(dǎo)愈傷組織，通過愈傷組織分化培養(yǎng)成功獲取不定芽[9,14,30-31]。相關(guān)研究通過白木香、印度沉香、馬來沉香、厚葉沉香、密毛沉香等帶芽莖段誘導(dǎo)出不定芽[8,15-20,32]。

2.2 外植體消毒

外植體進(jìn)行無菌培養(yǎng)時(shí)，消毒是關(guān)鍵的步驟之一。正確適當(dāng)?shù)南?，能夠有效抑制?xì)菌、真菌等微生物的繁殖，保證外植體在培養(yǎng)時(shí)不因染菌而受到侵害或死亡，提高成活率[30]。外植體消毒主要分為兩步，首先用洗潔精溶液浸泡和清水流動(dòng)沖洗0.5～1.0 h，除去表面污垢，其次在無菌環(huán)境中用適當(dāng)濃度乙醇、次氯酸鈉、升汞等溶液浸泡、晃動(dòng)一定時(shí)間，以消除外植體表面微生物等。Saikia等[33]在馬來沉香的愈傷組織培養(yǎng)中，將葉片用70%乙醇浸泡1 min 后5%～10%次氯酸鈉溶液處理15 min。賈賢[30]用0.1%的升汞處理白木香葉片和莖段8 min，得到最高存活率。用0.2%升汞處理種子8 min，得到最高存活率。有研究者通過實(shí)驗(yàn)得出，0.1%的升汞處理10 min 為白木香葉片是最佳消毒方式[8-9]。汪騰越[9]得出，用0.1%升汞浸泡10 min 也是白木香頂芽和莖段最佳消毒方式。Daud 等[34]在研究適合馬來沉香不同外植體（葉片、帶節(jié)莖段和種子）的滅菌技術(shù)時(shí)，采用苯菌靈對(duì)外植體預(yù)處理，結(jié)合升汞處理后獲得83%～90%的無菌且存活的材料。

升汞消毒和次氯酸鈉消毒能有效清除白木香外植體表面的微生物。實(shí)際操作過程中使用消毒液處理外植體時(shí)應(yīng)把握好消毒溶液濃度和處理時(shí)間，避免消毒時(shí)長不當(dāng)造成外植體的利用率下降和資源浪費(fèi)。外植體與消毒液接觸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致外植體褐變死亡，消毒時(shí)間過短則滅菌不徹底，外植體易受雜菌侵害，無法存活。

2.3 培養(yǎng)基的影響

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，培養(yǎng)基包含了植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、有機(jī)成分、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)以及水和瓊脂[9,35]。其中氮源是影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生的重要因素[12]。氮源主要以硝態(tài)氮（NO3--N）和氨 態(tài)氮（NH4＋-N）為主，兩者的比例對(duì)植物細(xì)胞的生長有很大的影響。通常，NO3--N 高有利于細(xì)胞增殖和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)[35]，硝酸銨（NH4NO3）的含量直接影響體細(xì)胞胚發(fā)生[12]。李湘陽等[36]通過地被銀樺試管苗增殖培養(yǎng)研究得出，較高濃度的硝酸銨（NH4NO3）會(huì)抑制地被銀樺試管苗生長。反之高含量的NH4＋-N則促進(jìn)細(xì)胞組織的器官分化和體細(xì)胞胚胎建成[35]。無機(jī)鹽中大量元素的配比在植物組織培養(yǎng)中對(duì)芽的誘導(dǎo)也十分重要。劉英等[37]在西南樺以芽繁芽組培快繁研究中得出，K∶Ca∶Mg=1.00∶0.04～0.08∶0.02～0.04，N∶P=1.00∶0.02～0.03時(shí)，西南樺側(cè)芽萌發(fā)正常，能夠迅速進(jìn)入增殖狀態(tài)。

沉香屬植物組織培養(yǎng)研究中，多選用MS 培養(yǎng)基和1/2 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，許多研究者在直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑中均通過MS培養(yǎng)基和1/2 MS 培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)愈傷組織分化和莖段腋芽、叢生芽萌發(fā)。葉勤法等[14]在MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出白木香愈傷組織，并用所產(chǎn)生的愈傷組織團(tuán)塊成功分化出芽。Saikia等[38]在馬來沉香的愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基更適合葉片和帶節(jié)莖段的愈傷組織誘導(dǎo)。何旭君等[15]在白木香組織培養(yǎng)中以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽并增殖。在沉香屬植物生根誘導(dǎo)中，1/2 MS 培養(yǎng)基更適用于兩步生根法。相關(guān)研究在沉香屬植物組織培養(yǎng)中采用兩步生根法，并在1/2 MS 培養(yǎng)基中成功獲得不定根[8,14,17,32]。而有研究采用一步生根法分別在1/2 MS、1/3 MS、7/10 MS培養(yǎng)基中獲得不定根[15,30,39]。

此外，Minh 等[18]在厚葉沉香的組織培養(yǎng)中得出，相比MS 培養(yǎng)基，WPM 培養(yǎng)基是更好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的結(jié)論。Hassan等[19]在WPM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)馬來沉香，誘導(dǎo)出較高長度的芽。筆者通過WPM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)出白木香不定根。因此，在后續(xù)的研究中，可嘗試改良MS 培養(yǎng)基的部分組成成分，調(diào)整氮源中硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的比例以及大量元素的配比，或嘗試其他低鹽度的培養(yǎng)基以達(dá)到更好的培養(yǎng)效果。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響

2.4.1 對(duì)愈傷組織形成和分化的影響 植物生長調(diào)節(jié)劑的添加配比決定了外植體的發(fā)育方向。沉香屬植物通過間接器官發(fā)生途徑培養(yǎng)再生植株過程中，愈傷組織誘導(dǎo)較容易，而愈傷組織分化形成不定芽較困難。誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化所用的植物生長調(diào)節(jié)劑有細(xì)胞分裂素和生長素，且通常情況下細(xì)胞分裂素的添加量大于生長素。Jayaraman等[40]在研究植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的影響中，加入2.2 μmol·L-1芐基氨基嘌呤（BAP）和1.1 μmol·L-1萘乙酸（NAA），能有效誘導(dǎo)馬來沉香葉外植體產(chǎn)生松軟的愈傷組織以建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。汪騰越[9]通過白木香莖段產(chǎn)生愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。并在MS+0.75 mg·L-16-BA+0.25 mg·L-1NAA 培養(yǎng)基中愈傷組織分化出不定芽。葉勤法等[14]在MS培養(yǎng)基中分別加入1.0 mg·L-1BAP和0.05 mg·L-1NAA愈傷組織不定芽分化最好。張翹等[7]以胚為組織培養(yǎng)外植體材料，在MS+0.5 mg·L-1玉米素（ZT）+0.1mg·L-1吲哚乙酸（IAA）培養(yǎng)基中叢芽誘導(dǎo)率最高。而蘭芹英等[41]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素小于或等于生長素時(shí)可以誘導(dǎo)愈傷組織分化，但分化率低，子葉愈傷組織在1/2 MS+0.5～2.0 mg·L-1BA+2 mg·L-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）中分化率僅為18.18%和22.73%。Saikia等[38]也表示在MS培養(yǎng)基中加入較低的細(xì)胞分裂素［0.1 mg·L-1激動(dòng)素（KT）］和較高的生長素（2 mg·L-12，4-D）獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的愈傷組織團(tuán)塊，但在MS 培養(yǎng)基中加入較高的細(xì)胞分裂素（1.0～2.0 mg·L-1BAP）和較低的生長素（0～0.5 mg·L-1NAA）能從新鮮的愈傷組織團(tuán)中誘導(dǎo)出不定芽。

2.4.2 對(duì)芽萌發(fā)的影響 相對(duì)于誘導(dǎo)愈傷組織分化，直接誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生方式的萌芽率更高。直接誘導(dǎo)芽萌發(fā)有操作簡(jiǎn)約、誘導(dǎo)時(shí)間短、變異概率小等特點(diǎn)。筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，莖段直接誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)獲得無菌材料后，有利于后續(xù)的不定芽產(chǎn)生和生根誘導(dǎo)。在促進(jìn)芽萌發(fā)和增殖的培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的添加量高于生長素的添加量，6-BA 使用量為0.05～2.00 mg·L-1，NAA使用量為0.01～0.20 mg·L-1。

林超[8]利用莖段成功誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA。何旭君等[15]研究表明，白木香莖段直接誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA。徐強(qiáng)興等[32]利用莖段直接誘導(dǎo)叢生芽，在1/2 MS+0.2 mg·L-16-BA 培養(yǎng)基中獲得最高芽誘導(dǎo)率和叢芽數(shù)量。Hassan等[19]在添加0.1 mg·L-1BAP的MS培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基中均獲得較高數(shù)量的密毛沉香叢生芽，且芽的長度最大。Minh等[18]添加1 mg·L-1BA和10%椰子水（CW）于WPM培養(yǎng)基中，厚葉沉香莖尖外植體和莖段外植體均能在該配比的培養(yǎng)基中產(chǎn)生初代芽。Debnath 等[20]在MS培養(yǎng)基中補(bǔ)充4 mg·L-1BAP 和0.5 mg·L-1NAA，可以在印度沉香帶節(jié)的莖段外植體上獲得大量的叢生芽。

2.4.3 對(duì)芽增殖的影響 增殖是組織培養(yǎng)的重要過程之一，也是組培苗能否進(jìn)入產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵部分[42]。許多學(xué)者在沉香屬植物組織培養(yǎng)中都建立了增殖體系。林超[8]得出叢生芽增殖的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA，何旭君等[15]得出叢生芽增殖培養(yǎng)基為2/3 MS+0.2 mg·L-16-BA+2 mg·L-1水解乳蛋白（LH）。Minh 等[18]利用0.1 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA 和10%CW 獲得最佳的增殖效果。Debnath 等[20]在添加0.2 mg·L-1BAP 的MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，芽的數(shù)量增加了18 倍。徐強(qiáng)興等[32]在1/2 MS+0.1 mg·L-16-BA 中獲得最高增殖率，且增殖芽生長正常，玻璃化率最低。增殖培養(yǎng)中，除了考慮植物生長添加劑的類型和濃度，細(xì)胞分裂素和生長素的比值也應(yīng)重視。細(xì)胞分裂素和生長素的比值較大時(shí)，有利于促進(jìn)叢生芽的形成，但總體濃度不應(yīng)過高[28]。增殖周期也是影響增殖效率的重要因素，周期過短，可能會(huì)導(dǎo)致增殖新芽數(shù)量少或質(zhì)量差；周期過長，會(huì)對(duì)已形成的新芽造成不利影響，并且加大成本[42]。

2.4.4 對(duì)生根的影響 在沉香屬植物組織培養(yǎng)中，生根是最關(guān)鍵的一步，且難度極大。許多研究認(rèn)為，在扦插生根中添加植物調(diào)節(jié)劑，能夠有效地調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素和酶類活動(dòng)，從而促進(jìn)植物生根[43]。在對(duì)一些較難生根樹種進(jìn)行扦插生根培養(yǎng)時(shí)，添加植物生長調(diào)節(jié)劑能夠有效地促進(jìn)根系發(fā)育。

針對(duì)沉香屬植物組織培養(yǎng)生根困難問題，除了常規(guī)的培養(yǎng)基生根方法外，研究者采用兩步生根法（間接生根法）、瓶外生根法和浸泡生根法都使無根組培苗產(chǎn)生不定根。這3種方法相似之處在于先將無根芽或苗用植物生長調(diào)節(jié)劑處理一定時(shí)間后轉(zhuǎn)移至不添加任何植物調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中。葉勤法等[13]將無根苗接種至1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生根率最高達(dá)94.4%。林超[8]將白木香不定芽接種至含0.1 mg·L-1NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基中，生根率可達(dá)到75%。此外，蘭芹英等[41]采用了瓶外生根，將無根組培苗用1000 mg·L-1的NAA 溶液處理20 min 后移栽到裝有粗沙的容器中，生根率達(dá)到85%。何夢(mèng)玲等[16]在印度沉香的組織培養(yǎng)中選擇將生根材料基部在無菌的1.0 mg·L-1NAA 溶液中浸泡48 h后，接入1/2 MS 培養(yǎng)基中，生根率達(dá)到90% 以上。Debnath 等[20]將印度沉香生根材料在含有40 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）的1/2 MS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后在含有2 mg·L-1IBA 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)1 周，最后轉(zhuǎn)移至不含植物生長添加劑但添加0.2%活性炭的培養(yǎng)基中可有效生根。

2.5 培養(yǎng)條件的影響

光照是植物光合作用的必需條件，同樣在植物組織培養(yǎng)中，光照是影響植株再生是否成功的重要環(huán)境因素之一。光照在組織培養(yǎng)中影響外植體的生長發(fā)育和增殖效果[44]。在藥用植物中，光照會(huì)影響黃酮類等次生物質(zhì)代謝[45]，而黃酮類化合物是與植物褐變密切相關(guān)的酚類物質(zhì)[46]。因此，適合的光照條件可激活植物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，并合成抗氧化物質(zhì)[47]，減少或避免植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中，光照質(zhì)量、數(shù)量以及光周期對(duì)植物生長發(fā)育有很大的影響。有研究表明，在木本植物組織培養(yǎng)中，LED 燈作為光源有助于植物生長并且提高代謝活性[48]。李湘陽等[49]在厚葉沉香組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，組培苗對(duì)光質(zhì)比較敏感，并通過研究證明LED 燈紅藍(lán)混合光（75%紅光+25%藍(lán)光或25%紅光+75%藍(lán)光）有利于組培苗的增殖，傳統(tǒng)的熒光燈并不是其最佳光源。此外，Minh 等[18]表示高強(qiáng)度的光照更有利于芽的增殖。

溫度對(duì)植物組培苗的增殖也是十分重要的，甘蔗作為熱帶、亞熱帶生長的碳四（C4）植物，在組織培養(yǎng)中，溫度達(dá)到28～30 ℃時(shí)，增殖系數(shù)最高[50]。沉香屬植物組織培養(yǎng)研究中，都明理等[51]得出，將普通的培養(yǎng)溫度25 ℃提高至（31±2）℃時(shí)，白木香叢生芽大量增殖且生長速度加快。Toruan-Mathius等[52]在研究馬來沉香種間體外微繁殖的相容性時(shí)，也將培養(yǎng)溫度提高至（27±2）℃。

3 存在問題及對(duì)策

植物組培技術(shù)在生產(chǎn)和試驗(yàn)探索中逐漸趨于成熟，但仍然存在影響組培成功的問題，尤其在木本植物的組培中，褐變、玻璃化、生根是普遍且關(guān)鍵的難題。

3.1 褐變及對(duì)策

褐變是影響組培成功的一大難題，尤其在木本植物組培中問題尤為嚴(yán)重[53]。外植體褐變分為酶促褐變和非酶促褐變，在植物組織培養(yǎng)中普遍認(rèn)為酶促褐變是導(dǎo)致組培物質(zhì)褐變的主要原因[54]。一般認(rèn)為，酶促褐變與多酚氧化酶（PPO）活性和總酚含量密切相關(guān)[53,55]。木本植物組織培養(yǎng)中影響褐變發(fā)生的主要因素有外植體類型、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基[56]。培養(yǎng)基根據(jù)無機(jī)鹽的成分含量可分為高鹽成分培養(yǎng)基、中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基和低無機(jī)鹽類培養(yǎng)基，如植物組織培養(yǎng)常用的MS 培養(yǎng)基屬于高鹽成分培養(yǎng)基。

沉香屬植物組織培養(yǎng)可以通過培養(yǎng)基改善褐變現(xiàn)象，除了使用降低濃度后的1/2 MS 培養(yǎng)基以外，采用低無機(jī)鹽類木本植物培養(yǎng)基WPM 來緩解褐化現(xiàn)象，B5 培養(yǎng)基也較適宜木本植物的組織培養(yǎng)[53]。還可以通過添加抗氧化劑抑制酚類氧化褐變，如添加VC、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、檸檬酸（CA）、二硫蘇糖醇（DTT）、植酸（PA）、半胱氨酸（CYS）、硝酸銀（AgNO3）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等能有效防止酚類氧化褐變；添加吸附劑吸附酚類化合物，如活性炭（AC）、PVP 等對(duì)減輕褐變現(xiàn)象有顯著作用[57-60]。除了添加一般的抗氧化劑和吸附劑之外，添加苯丙氨酸化合物抑制劑2-氨基脒-2-膦酸（2-aminoindane-2-phosphonic acid，AIP）也能有效減少組培過程中的褐變[61]，持續(xù)熱擊處理產(chǎn)生的hPSp 蛋白可以阻止苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性增加，從而控制褐化[54]。有研究表明，納米碳作為培養(yǎng)基添加物可以提高植物抗氧化能力，添加納米碳不僅可以抑制大花蕙蘭在組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的褐變現(xiàn)象，還有利于原球莖生長，且不影響其繼代增殖[62]。除此之外，選擇較嫩的外植體，適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)也能一定程度上減輕褐變。褐變是多種因素綜合作用導(dǎo)致的，在控制和減少褐變時(shí)也應(yīng)綜合利用多種措施[57]。

3.2 玻璃化及對(duì)策

玻璃化也是組織培養(yǎng)中常遇到的不良狀況。玻璃化是在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)半透明鮮綠水漬狀，伴隨著葉片卷曲或腫脹，且脆弱易碎等現(xiàn)象[57]。培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)環(huán)境可能導(dǎo)致玻璃化，培養(yǎng)環(huán)境濕度是造成玻璃化的重要因素之一，濕度過高會(huì)導(dǎo)致組培苗玻璃化，可以選擇透氣性好的材料用于組培瓶封口，降低濕度[28,63]。自然光照對(duì)玻璃化有一定的抑制作用，采用光自養(yǎng)微繁殖技術(shù)，使用大型培養(yǎng)容器，提高空氣流通性，能使玻璃化現(xiàn)象得到改善，促進(jìn)組培苗生長[63-64]。研究發(fā)現(xiàn)，降低NH4+能減少瑞香玻璃化苗，40 ℃電擊處理愈傷組織可以消除瑞香再生植株的玻璃化現(xiàn)象[65]。降低無機(jī)鹽和植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度、采取偏酸性的培養(yǎng)條件、弱光培養(yǎng)（暗培養(yǎng)）、加大晝夜溫差等都能有效緩解玻璃化問題[32,57]。

3.3 生根難及對(duì)策

生根效率低、所需時(shí)間長等現(xiàn)狀嚴(yán)重阻礙了沉香屬組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度和固化劑的種類是生根的決定因素[66]。低濃度的大量元素和微量元素培養(yǎng)基更有利于沉香屬植物生根；沉香屬植物間接生根的效果優(yōu)于直接生根[14]，根據(jù)該特征可通過改善生根方法提高生根率，適當(dāng)利用間接生根、瓶外生根和浸泡生根法培養(yǎng)沉香屬無根芽苗，或可將間歇浸沒式植物生物反應(yīng)器應(yīng)用于沉香屬植物組織培養(yǎng)。

4 展望

沉香作為瀕危藥材和名貴香料在中國使用歷史悠久，《本草綱目》記載：“海南沉香，一片萬錢，冠絕天下”，現(xiàn)今沉香仍在160多味中成藥中應(yīng)用[67]。中國古代四大香“沉檀龍麝”，沉香位列百香之首[68]，沉香也是國際高端香水的重要成分。人們對(duì)沉香資源的過度開發(fā)導(dǎo)致野生資源瀕危，為了保障沉香資源能夠可持續(xù)利用，我國及東南亞各國近年來大面積推廣沉香樹種植，主要用種子繁殖[2,69]。通體結(jié)香技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)明及少量傳統(tǒng)結(jié)香技術(shù)的應(yīng)用能夠解決部分藥用和后端沉香產(chǎn)業(yè)開發(fā)原料的供應(yīng)[70]，但仍不能滿足人們對(duì)高品質(zhì)沉香的需求。

實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，有少數(shù)種質(zhì)具有優(yōu)良的結(jié)香品質(zhì)，但無法通過種子繁育方式保留其生物性狀。采用無性繁殖的方式能保持繁殖母本遺傳基因型，獲得優(yōu)良穩(wěn)定的材料[71]。組織培養(yǎng)技術(shù)在沉香屬植物繁殖上的應(yīng)用經(jīng)過多年探索獲得了一定的成果，但是生根困難、褐變死亡、增殖效果不佳等仍然是組織培養(yǎng)再生植株的主要障礙。解決沉香屬組織培養(yǎng)中的阻礙問題，建立成熟穩(wěn)定的組培快繁技術(shù)體系對(duì)沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有極大的科學(xué)意義，能夠在為沉香產(chǎn)業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的結(jié)香樹種的同時(shí)，對(duì)沉香屬植物的保護(hù)和沉香資源可持續(xù)利用做出貢獻(xiàn)。組培快繁技術(shù)在沉香繁育方面的完善和應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)沉香的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大化，帶動(dòng)沉香產(chǎn)業(yè)成為我國沉香主產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展新動(dòng)力，并保持我國沉香產(chǎn)業(yè)在國際領(lǐng)先地位。因此，沉香屬的組培快繁技術(shù)需要進(jìn)一步深入研究，并大規(guī)模應(yīng)用。