PDX模型在肝細(xì)胞癌研究中的應(yīng)用*

張 鵬，蔡衛(wèi)華

（1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇226001；2南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院普外科）

肝癌是世界范圍內(nèi)高死亡率的惡性腫瘤之一，肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，近半數(shù)病例發(fā)生在我國，與我國肝炎病毒高感染率相關(guān)。手術(shù)治療是治愈HCC的唯一方法，但HCC發(fā)現(xiàn)常在疾病晚期，往往已失去手術(shù)機會。藥物治療成為晚期患者主要治療手段，多激酶抑制劑索拉菲尼是晚期HCC的一線治療藥物，隨著越來越多耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，促使人們尋找新的解決方法，近年來新型抗HCC藥物不斷問世，但患者預(yù)后仍不容樂觀[1-2]。

預(yù)測性良好的實驗?zāi)Ｐ湍軜O大促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化研究的順利進(jìn)行。人源腫瘤組織異種移植（patientderived xenograft，PDX）模型是指將源自患者的新鮮腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的一種異種移植模型。1969年RYGAARD等[3]將大腸癌患者的腫瘤組織移植到裸鼠皮下，成功建立了PDX模型。因為PDX模型成本高、樣本獲取有限等弊端，后來逐漸被腫瘤細(xì)胞系異種移植（cell-line-derived xenograft，CDX）模型取代。近幾年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞系CDX模型不能準(zhǔn)確反映腫瘤的異質(zhì)性，導(dǎo)致臨床前結(jié)果與實際臨床結(jié)果有較大差異[4]，因而PDX模型又重新被重視起來。PDX模型較好地保留腫瘤特征，具有良好的臨床預(yù)測性[2]，是目前最理想的腫瘤模型。本文重點介紹HCC PDX模型的建立方法、優(yōu)缺點及其在肝細(xì)胞癌研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對其前景進(jìn)行展望。

1 HCC PDX模型的建立

1.1 移植動物 HCC PDX模型需選用免疫缺陷小鼠。（1）裸鼠（nude mice）：裸鼠先天性胸腺缺陷，T細(xì)胞成熟障礙，B細(xì)胞功能低下，體內(nèi)免疫球蛋白主要為IgM，免疫力較低，但體內(nèi)固有免疫仍較完善，具有一定的移植排斥能力，在傳代過程中使得原始腫瘤的一些異質(zhì)性消失，總體成瘤率較低[5-6]。（2）重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficiency mice，SCID）：因16號染色體上DNA修復(fù)基因的突變，使得SCID小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫功能幾乎完全喪失，成瘤率較裸鼠高，但較完好的固有免疫使其實際運用受限[7]。（3）非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠：即非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠SCID雜交后的小鼠，既有SCID小鼠T、B淋巴細(xì)胞功能缺陷的特點，又具有NOD小鼠部分固有免疫功能降低的特點，其免疫缺陷程度更高，但壽命短，不適于較長時間的實驗研究[5，7-8]。（4）NCG/NSG/NOG小鼠：指在NOD/SCID基礎(chǔ)上敲除IL-2Rg基因的小鼠，系目前免疫缺陷程度最高的小鼠品系，免疫細(xì)胞分化成熟受阻，缺乏T、B、NK細(xì)胞，固有免疫和獲得性免疫均受損，免疫程度低，穩(wěn)定性好，生存期長[4]。NOD/SCID小鼠和NCG/NSG/NOG小鼠更適用于建立HCC PDX模型，移植成瘤率更高[8]。

1.2 移植部位 （1）皮下移植：操作簡單易行，且能直觀腫瘤大小，使用廣泛。GU等[9]將患者手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織植入SCID小鼠皮下，建立了一組HCC PDX模型，并證實在組織學(xué)和基因表達(dá)模式等方面與匹配的腫瘤組織高度一致。然而，皮下移植存在無法復(fù)現(xiàn)患者腫瘤生長微環(huán)境的復(fù)雜性，不能模擬轉(zhuǎn)移行為等缺陷，以致在HCC轉(zhuǎn)移及微環(huán)境對HCC生長影響等方面的研究受限[10]。（2）腎包膜下移植：該部位血供較豐富，基質(zhì)含量較多，建瘤成功率也較皮下移植高。有研究將腫瘤組織移植到裸鼠腎包膜下，成功建立了PDX模型，免疫組織化學(xué)、腫瘤標(biāo)志物等實驗證實在病理形態(tài)和分子特征等方面與原發(fā)腫瘤保持一致[11-12]。由于腎包膜下移植操作難度較大，移植成功后不易觀察和測量腫瘤組織的大小，對小鼠損傷大，該模型的發(fā)展受限[5]。（3）原位移植：將患者來源的腫瘤組織進(jìn)行原位異種移植（PDOX），可以提供與匹配的腫瘤組織相似的微環(huán)境，且血供豐富，極大保留了患者腫瘤的特異性[5，13]。有研究將離體腫瘤組織制成懸液，將懸液注入小鼠肝臟，完成組織懸液PDOX模型，利用PET/CT和HE染色評估建模狀況，證明組織形態(tài)學(xué)的一致性[13]。原位移植能較好模仿與匹配腫瘤相似的轉(zhuǎn)移特征，是目前最為理想的移植方式，但相較異位移植方式，其技術(shù)、成本及腫瘤評估等問題影響其廣泛應(yīng)用[14-15]。

1.3 影響移植成功的因素 PDX模型的成功構(gòu)建與多種因素有關(guān)，除上述移植動物及移植部位外，腫瘤惡性程度越高、組織中腫瘤細(xì)胞比例越大、組織離體時間越短，PDX模型越易構(gòu)建成功[2，5，14]。

2 HCC PDX模型的優(yōu)勢

CDX模型是將腫瘤細(xì)胞系移植到免疫缺陷小鼠皮下、腎包膜下或原位，但腫瘤細(xì)胞系是通過體外篩選、人工純化、體內(nèi)體外多次傳代而建立的穩(wěn)定細(xì)胞系，已喪失原始腫瘤組織的異質(zhì)性，無法準(zhǔn)確反映原始腫瘤的特征[6，16]。相對于CDX模型，PDX模型顯示以下優(yōu)勢：（1）直接將患者新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，較完整保持腫瘤組織生物學(xué)特性，因此臨床預(yù)測性更好；（2）可用于活體腫瘤的保存和傳代，為腫瘤研究提供大量標(biāo)本；（3）保留了腫瘤間質(zhì)，腫瘤生長微環(huán)境更接近原代腫瘤的生長情況，利于腫瘤微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞影響的研究；（4）PDX模型來源于不同患者，極大促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個體化用藥的發(fā)展。

3 HCC PDX模型的應(yīng)用

3.1 HCC生物學(xué)機制的研究 作為高度復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，HCC發(fā)病機理及關(guān)鍵驅(qū)動因素目前尚未完全闡明，PDX模型的研發(fā)和應(yīng)用極大地促進(jìn)相關(guān)機理的研究。目前研究表明，多種信號通路的失控導(dǎo)致HCC的發(fā)生發(fā)展，其中Wnt/β-catenin途徑在HCC發(fā)病機理中起著重要作用。免疫組化等研究證實，大多數(shù)HCC細(xì)胞系和患者來源的異種移植物（PDX）均顯示β-catenin被激活，對HCC細(xì)胞系敲除β-catenin，使用siRNA處理HCC細(xì)胞系后，功能實驗表明HCC細(xì)胞系對β-catenin的致癌依賴性與其在細(xì)胞系中的激活狀態(tài)有關(guān)。隨后研究者通過HCC腫瘤異種移植物，確定β-catenin在體內(nèi)維持HCC的重要作用，為開發(fā)靶向治療的新策略提供理論基礎(chǔ)[17]。PDX模型與原始腫瘤具有高度相似性，傳統(tǒng)細(xì)胞系和實驗?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)的生物學(xué)機制可以在PDX模型中驗證，有助于盡早闡明HCC相關(guān)機理。

3.2 研究抗HCC藥物耐藥性，探尋治療新策略 由于索拉菲尼耐藥病例的不斷增加，研究者一直致力于開發(fā)能取代索拉菲尼的新型抗HCC藥物[6]。探索索拉菲尼耐藥機制，探尋HCC治療新策略是目前HCC研究新方向[18]。低異質(zhì)性的細(xì)胞系不利于索拉菲尼耐藥性研究，而基于患者新鮮腫瘤組織的PDX模型有望更有前景。有研究成功建立了16個HCC PDX模型，分別對索拉菲尼敏感和耐藥進(jìn)行研究，通過分析兩者表達(dá)譜的差異，確定KPNA3為引起HCC進(jìn)展和索拉菲尼耐藥的潛在分子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KPNA3通過激活A(yù)KT-ERK軸上調(diào)TWIST表達(dá)，從而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致HCC細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥性[18]，這項研究提供了抗KPNA3與索拉菲尼聯(lián)合治療新策略。另外，有研究者成功建立了耐索拉菲尼的體外HCC細(xì)胞和體內(nèi)HCC PDX模型，耐索拉菲尼細(xì)胞明顯表現(xiàn)出腫瘤原始細(xì)胞特性，并且腫瘤起始細(xì)胞標(biāo)記物CD47顯著上調(diào)。體外HCC細(xì)胞和體內(nèi)HCC PDX模型均證實耐索拉菲尼的HCC細(xì)胞激活核因子κB，核因子κB通過CD47啟動子中的特定反應(yīng)元件調(diào)控CD47表達(dá)。敲除CD47和使用抗CD47抗體，對索拉菲尼敏感性增加，并在HCC PDX模型中證實抗CD47和索拉菲尼聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同治療作用[19]，為HCC治療提供抗CD47聯(lián)合索拉菲尼的新策略。

3.3 抗HCC藥物的研發(fā) 抗癌藥物開發(fā)的主要問題之一是臨床前實驗與臨床結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，大量臨床前藥物最終不能用于臨床，藥物應(yīng)答率與臨床結(jié)果相近的PDX模型有望改變這一現(xiàn)狀?？笻CC藥物研發(fā)和臨床前實驗是目前HCC PDX模型最廣泛的用途[20-24]。有研究對HCC高選擇性小分子MET抑制劑AMG337進(jìn)行臨床前評估，證實AMG337在體外具有抗HCC細(xì)胞系增殖活性，AMG337敏感性及MET擴增與蛋白質(zhì)過表達(dá)呈強相關(guān)性；分析在AMG337處理HCC PDX樣本后MET擴增與蛋白質(zhì)過表達(dá)的發(fā)生率，以及在建立的MET擴增與蛋白質(zhì)過表達(dá)的HCC PDX模型中AMG337的抗腫瘤活性，有助于為MET驅(qū)動的肝細(xì)胞癌患者提供治療策略[23]。由于成本高、樣本獲取有限、模型建立成功率低，阻礙PDX模型的抗HCC藥物研發(fā)，目前已有研究人員建立了肝癌PDX公共數(shù)據(jù)庫和PDX模型衍生的細(xì)胞系[25-26]，用于解決上述問題，有助于更便捷地進(jìn)行HCC相關(guān)研究。

3.4 生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)的鑒定 識別腫瘤組織或癌旁組織中特異性表達(dá)的生物標(biāo)志物，并通過與臨床結(jié)果有高度一致性的實驗?zāi)Ｐ图右宰C實，對于HCC早期診斷、預(yù)后判斷及靶向治療的發(fā)展至關(guān)重要[27]。目前，PDX模型已逐漸用于尋找HCC生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)的研究中[18，27-29]。一項腫瘤標(biāo)志物的研究檢測74個腫瘤組織和癌旁組織的基因表達(dá)，識別出HCC組織中高表達(dá)的標(biāo)志物CD133和CD44，并通過對患者的隨訪對其預(yù)后進(jìn)行評估，并與HCC PDX模型得出一致結(jié)果[27]，表明CD133和CD44具有臨床預(yù)后判斷價值，也證實PDX模型對臨床結(jié)果的預(yù)測作用，提示PDX模型在轉(zhuǎn)化研究中的價值。

3.5 指導(dǎo)個性化治療 不同HCC患者存在分子差異，對同一種治療的敏感性不同，因此，應(yīng)用個性化腫瘤移植模型指導(dǎo)治療決策的研究正在興起[8]。源于患者腫瘤組織的PDX模型較好保留原發(fā)腫瘤的特征和相似的生物學(xué)行為，反映不同患者的特征[30]。在一項研究中成功建立了6例HCC PDX模型，對其中1例進(jìn)行索拉菲尼的藥效學(xué)評價，并在臨床同步使用索拉菲尼，結(jié)果表明索拉菲尼對該患者療效不佳，提示PDX模型實驗結(jié)果能反映體內(nèi)原發(fā)腫瘤的藥敏結(jié)果[2]，顯示PDX模型指導(dǎo)個性化治療的前景。

4 結(jié)語與展望

目前，PDX模型正逐漸取代傳統(tǒng)CDX模型的地位，研究者們正不斷嘗試將PDX模型運用到包括HCC在內(nèi)的各種實體瘤的研究中，盡力使得研究結(jié)果更接近實際情況。但PDX模型仍存在一些缺陷：（1）組織樣本獲取有限：PDX模型直接取自手術(shù)患者，需要得到倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意；（2）實驗動物免疫缺陷：PDX模型建立需要重度免疫缺陷動物，在一定程度上限制了HCC免疫系統(tǒng)相關(guān)研究及免疫治療藥物的研發(fā)；（3）移植技術(shù)要求高：PDX模型的建立需要手術(shù)者、組織病理學(xué)專家及研究者的密切配合，最終移植成瘤率較傳統(tǒng)CDX模型低；（4）建模費用高，周期長。研究者一直致力于克服上述缺陷，例如重建人免疫系統(tǒng)+人源腫瘤組織異種移植動物模型、PDX模型數(shù)據(jù)庫不斷完善、基于穿刺活檢建立的HCC PDX模型的研究、體外培養(yǎng)PDX模型衍生細(xì)胞等，以完善PDX模型。