分子診斷在甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的應(yīng)用和進(jìn)展

夏 葦 綜述，張玉洪 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率明顯增加，已成為發(fā)病率增加速度最快的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中排名第4[1]。甲狀腺癌有4種病理類型：甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡癌(二者合稱分化型甲狀腺癌)、甲狀腺髓樣癌以及甲狀腺未分化癌，其中PTC最常見。PTC的總體病死率較其他惡性腫瘤低，預(yù)后較好，但部分患者接受了手術(shù)和放射性碘治療后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。雖然超聲、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)(FNAC)診斷等檢查手段使大部分甲狀腺結(jié)節(jié)得到明確診斷，但仍有部分患者存在漏診或過度治療的情況。隨著基因組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)用于腫瘤的病因和治療靶點的研究，多種分子標(biāo)志物被分析鑒定與應(yīng)用。利用分子診斷技術(shù)對腫瘤進(jìn)行分子分型和個體化用藥指導(dǎo)顯得非常重要。本文就甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷的同時利用分子診斷技術(shù)對相關(guān)基因檢測進(jìn)行綜述，目的是更深層次地理解各項分子診斷技術(shù)的優(yōu)缺點，指導(dǎo)臨床選擇最合適的分子診斷試驗，以達(dá)到臨床效益的最大化。

1 甲狀腺細(xì)胞學(xué)診斷的局限性

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，越來越多的甲狀腺結(jié)節(jié)被檢出，大部分甲狀腺結(jié)節(jié)為良性病變，僅少數(shù)為惡性。甲狀腺FNAC是術(shù)前鑒別結(jié)節(jié)良惡性結(jié)節(jié)最經(jīng)典的方法。該技術(shù)是在超聲引導(dǎo)下，將細(xì)針穿刺進(jìn)病變組織，利用負(fù)壓吸引出細(xì)胞，將吸引物涂片染色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)Bethesda報告系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。Bethesda報告系統(tǒng)共包含6個類別：Ⅰ，標(biāo)本無法診斷或取材不滿意；Ⅱ，良性病變；Ⅲ，意義不明確的細(xì)胞非典型病變,或意義不明確的濾泡性病變(AUS/FLUS)；Ⅳ，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤 (如為許特爾細(xì)胞型需備注)(FN/SFN)；V，可疑惡性(SM)；Ⅵ，惡性[2]。其中AUS/FLUS、FN/SFN和SM這3種類別為細(xì)胞學(xué)診斷不確定的結(jié)節(jié)。由于最新的2017版甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報告系統(tǒng)增加了具有乳頭狀核特征的非浸潤性甲狀腺濾泡性腫瘤(NIFTP)的診斷，并且不再將其判定為甲狀腺癌，則修改后的AUS/FLUS、FN/SFN和SM結(jié)節(jié)的惡性風(fēng)險分別為6%～18%、10%～40%和45%～60%[2]。盡管Bethesda報告系統(tǒng)的推廣使得甲狀腺細(xì)胞學(xué)診斷的定義更加規(guī)范，但各個機構(gòu)給出的6個類別的惡性風(fēng)險存在差異，且細(xì)胞病理醫(yī)師的經(jīng)驗不同，診斷一致率僅70%左右，因此仍有約10%～40%的結(jié)節(jié)無法獲得明確的良惡性診斷[3]。分子診斷的出現(xiàn)有助于明確甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷，指導(dǎo)臨床管理，從而避免不必要的手術(shù)。

2 甲狀腺癌的分子標(biāo)志物

2.1BRAF基因 BRAF基因即鼠類肉瘤濾過性病毒致癌同源體B1，是位于人類第7號染色體長臂的原癌基因，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的一環(huán)，編碼的BRAF蛋白屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、分化和凋亡方面有重要作用[4]。BRAF基因有多種突變類型，其中最常見的是V600E突變，即第1799位置的胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰?，從而使?00位密碼子編碼的纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔籅RAF V600E突變導(dǎo)致BRAF激酶形成活性構(gòu)象，持續(xù)激活MAPK通路的下游信號分子，同時抑制抑癌基因的作用，導(dǎo)致細(xì)胞不斷分裂、增殖形成腫瘤細(xì)胞[5]。有文獻(xiàn)報道BRAF V600E突變可增加基因組的不穩(wěn)定性，引起TSH信號通路激活，從而使細(xì)胞更具有侵襲性[6]。BRAF V600E突變還可以導(dǎo)致鈉碘同向轉(zhuǎn)運體啟動子的組蛋白去乙?；光c碘同向轉(zhuǎn)運體基因沉默，導(dǎo)致PTC患者富集碘能力減弱，對131I治療的敏感性降低[7]。

BRAF V600E是PTC中最常見的分子改變，對于PTC具有高度特異性，存在于36%～80%的乳頭狀癌中，研究表明其不存在于甲狀腺濾泡癌、髓樣癌和良性病變中[8]。最新版的Bethesda報告系統(tǒng)中建議對于細(xì)胞學(xué)無法診斷的病例可進(jìn)行分子診斷[2]。有研究發(fā)現(xiàn)中國PTC患者的BRAF V600E突變率高達(dá)87.7%，BRAF V600E診斷乳頭狀癌的特異度和陽性預(yù)測值均高達(dá)100%[9]。鑒于BRAF V600E突變對于PTC的高度特異性，許多學(xué)者認(rèn)為一旦存在BRAF V600E突變，幾乎就可以診斷為PTC[10-11]。一項包含88個研究的Meta分析顯示，聯(lián)合FNAC和BRAF V600E突變檢測可將靈敏度由81.4%提高至87.4%，假陰性率由8%降至5.2%；進(jìn)一步分析顯示，BRAF V600E突變檢測的診斷價值在不同細(xì)胞學(xué)診斷不確定分類中的價值不同，BRAF V600E突變檢測在SM和AUS/FLUS結(jié)節(jié)的靈敏度(59.4%和40.1%)明顯高于FN/SFN結(jié)節(jié)(19.5%)，ROC曲線分析也證實BRAF V600E突變檢測在SM和AUS/FLUS結(jié)節(jié)中的診斷價值更高[11]。

BRAF V600E蛋白激酶具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長和分裂的功能，因而受到廣泛關(guān)注，大量研究探討B(tài)RAF V600E突變與各項臨床病理特征的關(guān)系。體外試驗顯示出BRAF V600E突變與PTC侵襲性特征高度一致的結(jié)果，而臨床試驗呈現(xiàn)出截然相反的結(jié)果，使得BRAF V600E突變能否作為PTC的侵襲性標(biāo)志物仍有爭議。大多數(shù)研究認(rèn)為BRAF V600E突變與更差的臨床病理特征有關(guān)，如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、更差的腫瘤分期、侵襲性亞型、腫瘤大小、男性、老年等有關(guān)，因此推薦在甲狀腺全切術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行中心淋巴結(jié)清掃，同時術(shù)后予以更嚴(yán)格的放射性碘治療和密切的隨訪[12]。然而一些研究未發(fā)現(xiàn)存在上述關(guān)聯(lián)[13]。這些研究存在差異可能是由研究納入的樣本量、患者的流行病學(xué)特征、乳頭狀癌亞型、用于分子檢測的標(biāo)本種類和檢測方法等不同造成的。

2.2RAS基因 RAS基因包括3種類型(HRAS、NRAS、KRAS),其通過調(diào)節(jié)MAPK和PI3K-AKT通路從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化。RAS基因突變是甲狀腺結(jié)節(jié)中第2常見的分子改變，可發(fā)生在多種類型的甲狀腺腫瘤中，包括甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、PTC、濾泡變異性PTC和甲狀腺未分化癌等。研究顯示RAS突變在分化較差的甲狀腺癌和甲狀腺未分化癌中的發(fā)生頻率更高，表明其更傾向于和腫瘤的進(jìn)展而不是腫瘤的起源有關(guān)[14]。在PTC中，RAS基因突變很少與BRAF突變同時存在，顯示出其具有獨立的促進(jìn)乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展的作用[15]。由于甲狀腺濾泡癌的診斷條件必須包括包膜和(或)血管侵犯，僅憑FNAC診斷很難做出明確診斷。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺濾泡癌和濾泡變異性PTC中RAS基因突變的頻率要高于BRAF基因突變，因此聯(lián)合RAS和BRAF基因突變檢測有助于提高甲狀腺濾泡癌和濾泡變異性PTC的檢出率[16]。部分RAS基因突變的甲狀腺結(jié)節(jié)經(jīng)術(shù)后病理證實為甲狀腺腺瘤，從而增加了RAS基因突變假陽性的概率，但研究表明攜帶有RAS基因突變的甲狀腺腺瘤患者后期易發(fā)展為分化較差和更具侵襲性病理特征的甲狀腺癌。一項Meta分析顯示在診斷不明確的甲狀腺結(jié)節(jié)中，RAS基因突變檢測的特異度和陽性預(yù)測值分別為93.5%和78%[17]。

2.3RET/PTC基因重排 RET基因是一種原癌基因，編碼的RET蛋白為酪氨酸蛋白激酶受體；RET蛋白主要在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞或C細(xì)胞中表達(dá)，而在甲狀腺濾泡細(xì)胞中是否表達(dá)仍有爭議[18]。RET基因可與多種異源基因發(fā)生融合，產(chǎn)生至少13種不同的RET/PTC重排類型，從而激活RAS-RAF-MAPK信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞不斷增殖、分化，形成腫瘤細(xì)胞[18]。RET/PTC重排最常見的類型為RET/PTC1和RET/PTC3，二者占比達(dá)90%以上。研究表明，RET/PTC重排在兒童患者和有放射性物質(zhì)接觸史的患者中發(fā)生頻率較高[19]。放射性物質(zhì)可導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，增加DNA結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，從而有利于RET基因和其他非相關(guān)基因發(fā)生基因重排[20]。

2.4PAX8/PPARγ基因重排 PAX8/PPARγ在甲狀腺癌中的發(fā)生頻率較低，單獨出現(xiàn)PAX8/PPARγ重排對甲狀腺癌的診斷價值有限，但其對甲狀腺癌的包膜侵犯和血管浸潤有一定的提示意義。關(guān)于PAX8/PPARγ的研究數(shù)據(jù)較少，一項Meta分析顯示11項研究中共有20個結(jié)節(jié)存在PAX8/PPARγ，PAX8/PPARγ的陽性預(yù)測值為55%[21]。

3 甲狀腺分子診斷技術(shù)的進(jìn)展

3.17種基因聯(lián)合檢測 約70%的甲狀腺癌可出現(xiàn)以下至少一種分子改變：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、RET/PTC1、RET/PTC3和PAX8/PPARγ[10]。聯(lián)合檢測這7種分子標(biāo)志物有助于提高細(xì)針穿刺抽吸(FNA)的特異度和陽性預(yù)測值,從而輔助診斷甲狀腺癌。但其靈敏度不夠，未檢測到突變不能排除甲狀腺癌。NIKIFOROV等[10]在細(xì)胞學(xué)診斷不明確的甲狀腺結(jié)節(jié)中檢測了以上7種分子標(biāo)志物，結(jié)果顯示在AUS/FLUS、SFN/FN結(jié)節(jié)和SM結(jié)節(jié)中的靈敏度分別是63%、57%和68%，特異度分別是99%、97%和96%。在AUS/FLUS、SFN/FN、SM結(jié)節(jié)中檢出任何一種突變提示惡性風(fēng)險分別高達(dá)88%、87%、95%，然而未檢出突變?nèi)匀惶崾続US/FLUS、SFN/FN、SM結(jié)節(jié)分別存在5.9%、14%、28%的惡性風(fēng)險。2015年的美國甲狀腺學(xué)會(ATA)指南出版之前，臨床上對7種基因試驗陽性者建議直接進(jìn)行甲狀腺全切術(shù)，而不是葉切除術(shù)，可減少診斷性葉切除術(shù)后證實為惡性者進(jìn)行二次手術(shù)的概率。而2015年的ATA指南推薦小于4 cm的甲狀腺癌即使7種基因試驗檢出任何突變，仍可進(jìn)行葉切除術(shù)，這進(jìn)一步減弱了7種基因試驗在臨床手術(shù)決策中的作用。

3.2Afirma基因表達(dá)分類器(GEC) 根據(jù)美國國家癌癥研究所提出的評估診斷檢測方法的指南，一種好的檢測方法應(yīng)該將95%的病例排除在癌癥之外。細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為良性的陰性預(yù)測值高達(dá)97%，理想的分子診斷測試也應(yīng)達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)。Afirma GEC使用微陣列芯片技術(shù)測試了167種基因的mRNA表達(dá)活性，包括了用于鑒別良性(Afirma GEC結(jié)果為陰性)和可疑惡性(Afirma GEC結(jié)果為陽性)結(jié)節(jié)的142種基因以及用于篩選罕見腫瘤(如轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、嗜酸性腫瘤等)的25種基因。ALEXANDER等[22]開展了一項大樣本、多中心、前瞻性的研究，結(jié)果顯示通過Afirma GEC檢測基因的表達(dá)能降低超過一半以上不必要的甲狀腺癌手術(shù)率。良性的Afirma GEC結(jié)果在細(xì)胞學(xué)診斷不明確的結(jié)節(jié)中的靈敏度和陰性預(yù)測值分別是92%和93%。該研究表明Afirma GEC基因表達(dá)檢測結(jié)果為良性的預(yù)測準(zhǔn)確性與細(xì)胞病理學(xué)檢查為良性結(jié)果的預(yù)測準(zhǔn)確性是相似的，但其特異度和陽性預(yù)測值僅為52%和47%，無法正確地識別出惡性病灶。

雖然已有多項研究證實了Afirma GEC在降低不必要的甲狀腺癌手術(shù)率方面的價值，但仍有部分研究質(zhì)疑Afirma GEC在臨床實踐中的效益。針對細(xì)胞學(xué)診斷為許特爾細(xì)胞型的甲狀腺結(jié)節(jié)，研究顯示Afirma GEC的特異度降低，假陽性率增加，限制了其在這一特殊類型結(jié)節(jié)中的應(yīng)用。BRAUNER等[23]進(jìn)行的研究顯示，43例Afirma GEC結(jié)果為可疑惡性的許特爾細(xì)胞型患者進(jìn)行了手術(shù)，術(shù)后僅6例患者為惡性，即86%(37/43)的患者進(jìn)行了不必要的手術(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)使用Afirma GEC并沒有明顯地改變臨床手術(shù)的決策，僅8.4%(23/273)的患者根據(jù)Afirma GEC的結(jié)果改變了臨床治療方案[24]。不同的研究結(jié)論存在差異可能是由于各個機構(gòu)的甲狀腺結(jié)節(jié)惡性率、貝塞斯達(dá)系統(tǒng)各分類占比、許特爾細(xì)胞型占比、隨訪時間等不同所致。

3.3ThyroSeq 隨著癌癥基因組圖譜的繪制及高通量測序(NGS)技術(shù)的發(fā)展，7種基因聯(lián)合檢測和Afirma GEC的局限性將被逐漸克服。2014年，表現(xiàn)優(yōu)異的基于NGS技術(shù)的ThyroSeq v2測定板被應(yīng)用于FN/SFN結(jié)節(jié)，其可檢測15種點突變和42種基因融合，結(jié)果顯示ThyroSeq v2的靈敏度和特異度可達(dá)90%和93%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為83%和96%[25]。之后又評估了ThyroSeq v2在AUS/FLUS結(jié)節(jié)中的診斷價值，靈敏度和特異度分別為90.9%和92.1%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為76.9%和97.2%[26]。ThyroSeq v2同時有著較高的靈敏度和特異度。最新版的ThyroSeq v3將檢測基因數(shù)增加至112，包括5種分子改變形式：點突變、插入/缺失、基因融合、拷貝數(shù)改變和異?；虮磉_(dá)，將其應(yīng)用于FNA標(biāo)本中得到的靈敏度為98.0%,特異度為81.8%,正確度為90.9%[27]。隨著ThyroSeq版本中檢測基因數(shù)量的增加，該試驗的靈敏度也逐漸提高，顯示出更高的臨床應(yīng)用價值。

4 分子診斷面臨的挑戰(zhàn)

4.1帶乳頭狀細(xì)胞核特征的非侵襲性濾泡型甲狀腺腫瘤(NIFTP)概念的提出 2015年，NIKIFOROV等人提出了NIFTP這一新的組織病理學(xué)診斷，其原來被稱為非浸潤性包裹性濾泡亞型PTC，NIFTP不再被認(rèn)為是甲狀腺癌，而僅具有極低度惡性潛能。NIFTP與濾泡亞型乳頭狀癌最主要的區(qū)別點是NIFTP不具有血管或包膜侵犯，主要診斷標(biāo)準(zhǔn)還包括包裹性或界限清楚、濾泡生長模式和乳頭狀癌的核特征等。按照新的診斷標(biāo)準(zhǔn)，43.5%的濾泡亞型乳頭狀癌和4.4%的乳頭狀癌現(xiàn)在應(yīng)該被診斷為NIFTP，導(dǎo)致了術(shù)后惡性率的降低[28]。一項研究分析了增加NIFTP診斷對甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報告系統(tǒng)各個類別惡性率的影響，結(jié)果顯示AUS/FLUS、FN/SFN結(jié)節(jié)和SM結(jié)節(jié)的術(shù)后惡性率降低最明顯，分別降低了20%、30.8%和31.9%[29]。本綜述中的部分研究發(fā)生在NIFTP診斷提出之前，因此，我們需要對上述分子檢測的實際用途保持謹(jǐn)慎，未來需要更多包含NIFTP類別的研究，校準(zhǔn)分子檢測的診斷價值。

4.2分子標(biāo)志物與病理的關(guān)系 分子標(biāo)志物陰陽性與術(shù)后病理良惡性之間的關(guān)系并不精確。BRAF V600E突變是PTC中最特異的指標(biāo)，其在良性病變中不存在，但不是所有的乳頭狀癌均攜帶BRAF V600E突變，未檢出BRAF V600E突變不能排除乳頭狀癌。而RAS突變、RET/PTC、PAX8/PPARγ在良性病變中的概率分別達(dá)48%、68%、55%[30]。因此良性病變可以攜帶突變，惡性病變可以不攜帶突變。在967個細(xì)胞學(xué)診斷不確定的甲狀腺結(jié)節(jié)中，檢出任一突變的惡性率為89%，而未檢出任何突變的惡性率仍有11%。因此目前的分子檢測試驗的診斷價值仍未達(dá)到理想標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)一步提升分子檢測技術(shù)的檢測性能。

4.3隨訪時間 部分研究中分子檢測結(jié)果為陰性的病例沒有進(jìn)行手術(shù)獲得術(shù)后病理結(jié)果這一金標(biāo)準(zhǔn)，僅憑長期隨訪就確定為良性，當(dāng)隨訪時間沒有達(dá)到足夠長時，可能會將患者誤分類為良性，因此需要多中心、大樣本、長期的前瞻性研究隨訪細(xì)胞學(xué)不確定、分子檢測呈陰性的結(jié)節(jié)的性質(zhì)以期更客觀地評價分子檢測的診斷價值。

4.4標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運 大部分分子檢測試驗需要進(jìn)行額外細(xì)針穿刺獲取專門用于分子檢測的穿刺液標(biāo)本，并且需要保存在專用的細(xì)胞保存液中。已有研究探討了使用穿刺針殘留物標(biāo)本進(jìn)行分子檢測的可行性，未來將朝著低樣本量、高通量方向逐漸發(fā)展。分子檢測試驗存儲和轉(zhuǎn)運的要求也較普通檢驗項目更為嚴(yán)格，如有偏差可能會影響試驗結(jié)果。由于大部分分子檢測試驗僅在大型醫(yī)療機構(gòu)及發(fā)達(dá)地區(qū)開展，這無疑增加了標(biāo)本轉(zhuǎn)運時間及報告發(fā)布周期。未來分子檢測試驗的普及將克服這些挑戰(zhàn)。

5 小結(jié)與展望

細(xì)胞學(xué)診斷不確定的病灶是甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的最大難點。盡管這部分結(jié)節(jié)大多數(shù)術(shù)后為良性，但單獨依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)通常難以診斷。分子診斷的出現(xiàn)可以提供更多的危險分層信息，以指導(dǎo)臨床決策。分子標(biāo)志物的分析不僅僅可用于診斷，其在預(yù)后及治療方面的作用也日益顯著，可為放射性碘治療和全身治療提供信息。進(jìn)一步了解導(dǎo)致甲狀腺癌的分子突變，可能有助于開發(fā)針對高?；颊叩男滤?，改變攜帶特定突變患者的治療方法，更有針對性地進(jìn)行危險分層和預(yù)后討論。

甲狀腺癌病理診斷和分子診斷面臨的挑戰(zhàn)和機遇正變得越來越明顯。與此同時，精準(zhǔn)醫(yī)療是臨床應(yīng)用的發(fā)展趨勢，其需要準(zhǔn)確度高和快速的測試，從而有效地消除傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的反復(fù)試驗和錯誤。同時，臨床醫(yī)師、病理醫(yī)師和檢驗醫(yī)師應(yīng)知道，任何試驗都存在優(yōu)勢和不足。對于不確定的甲狀腺結(jié)節(jié)，必須綜合考慮所有臨床資料和實驗室結(jié)果才能做出最終決策。