環(huán)狀RNA在胰腺癌中的研究進(jìn)展

王硯偉，梁雨榮

解放軍總醫(yī)院 肝膽胰外科醫(yī)學(xué)部，解放軍總醫(yī)院肝膽外科研究所，全軍數(shù)字肝膽外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100853

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人類惡性程度最高的腫瘤之一[1]。其最主要的病理類型是導(dǎo)管腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，約占85%[2]。胰腺癌具有高度的侵襲性，以病死率高、預(yù)后差為特點(diǎn)，中位生存期為3～6個(gè)月，目前5年總生存率為8%左右[3-4]。胰腺癌僅占所有癌癥發(fā)病數(shù)的2%，但卻占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的5%，在無(wú)癥狀癌癥中居于首位[5]。近年來(lái)，其發(fā)病率逐漸上升，根據(jù)西方國(guó)家的統(tǒng)計(jì)，預(yù)計(jì)到2030年，胰腺癌將超過(guò)乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌，成為僅次于肺癌的第二大癌癥相關(guān)死亡原因[6]。目前中國(guó)每年的胰腺癌新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)均已經(jīng)超過(guò)了美國(guó)，胰腺癌的健康負(fù)擔(dān)逐年增加[3]?，F(xiàn)階段手術(shù)切除仍是胰腺癌最有效的治療措施[7]。然而，由于胰腺癌早期癥狀并無(wú)特異性，同時(shí)又缺乏有效的篩查策略，僅15%～20%的患者能夠接受手術(shù)切除，其余80%～85%的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)即為轉(zhuǎn)移性或局部晚期而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此尋找一種行之有效的早期診斷方法和靶向治療策略是當(dāng)下的迫切需求[8]。隨著基因芯片和RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)大量環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)異常，并且通過(guò)調(diào)控下游靶分子如微小RNA(micro RNA，miRNA)或RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein，RBP)參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、自噬及免疫逃逸，并與腫瘤TNM分期及患者的預(yù)后相關(guān)，有潛力成為胰腺癌診斷和治療的靶點(diǎn)，為胰腺癌的診治帶來(lái)了希望[9]。本文對(duì)胰腺癌組織中異常表達(dá)的circRNA展開(kāi)討論，總結(jié)了其生物學(xué)特性和作用機(jī)制，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了探討。

1 circRNA的結(jié)構(gòu)和功能

共價(jià)閉合circRNA最初在植物類病毒、酵母線粒體和D型肝炎病毒中被發(fā)現(xiàn)，一度被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接的產(chǎn)物，直到近些年其重要性才逐漸被發(fā)現(xiàn)并深入研究[10]。circRNA是一類長(zhǎng)度為200～2 000 bp的特殊非編碼RNA分子，屬于長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的一種[11]。不同于典型的線性RNA，circRNA是信使RNA(messenger RNA，mRNA)前體反向剪接并由共價(jià)鍵連接的封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)[12]。根據(jù)其來(lái)源不同，可分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA以及基因間circRNA，其中外顯子來(lái)源的circRNA占絕大多數(shù)[9]。由于circRNA分子是封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不具備5′端帽子和3′端poly(A)尾，因而不易被RNA酶水解，具有十分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以廣泛存在于外泌體和血漿中，具有高度的保守性和組織特異性[13-14]。

circRNA的生物學(xué)功能：1)作為miRNA海綿(sponge)。由于circRNA含有豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，吸附miRNA, 抑制其與下游靶基因的結(jié)合，從而間接地調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平[15]。2)與RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein，RBP)相互作用。一些circRNA可以與RBP結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，如circ-Foxo3和circ-MBL，circ-Foxo3能夠與多種類型的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)與CDK2、P21相互作用抑制細(xì)胞周期，阻斷細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，調(diào)控細(xì)胞的增殖[9]。3)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)，一部分定位于細(xì)胞核中的circRNA，如circ-EIF3J和circ-PAIP2，可以與抗U1小核糖核蛋白抗體(U1 snRNP)結(jié)合，進(jìn)一步與RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)相互作用，上調(diào)其親本基因的表達(dá)[16]。4)蛋白質(zhì)翻譯。有研究報(bào)道顯示，少數(shù)環(huán)狀RNA具有翻譯成蛋白質(zhì)的潛力，如circ-ZNF609在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的驅(qū)動(dòng)下，可以翻譯小鼠成肌細(xì)胞中的蛋白，這對(duì)circRNA是非編碼RNA的傳統(tǒng)觀念提出了質(zhì)疑[17]。

2 胰腺癌領(lǐng)域相關(guān)的circRNA

2.1 circNFIB1 circNFIB1在circBase中的代碼為hsa_circ_0086375，定位于chr9：14146687-14155892。由于其來(lái)源于核因子I/B(NFIB)基因位點(diǎn)的第16～18外顯子，因此被命名為circNFIB1[18]。Kong等[18]分析了160例胰腺癌標(biāo)本的circNFIB1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TMN分期的患者circNFIB1表達(dá)水平較低；qRT-PCR分析顯示，與配對(duì)的原發(fā)灶相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞中的circNFIB1水平更低，提示circNFIB1表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。在進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)中，利用siRNAs沉默circNFIB1，與對(duì)照組相比，人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成和遷移能力明顯增強(qiáng)；Transwell實(shí)驗(yàn)也表明，circNFIB1基因沉默促進(jìn)了PANC-1、CAPAN-2和SW1990細(xì)胞的遷移能力；以上結(jié)果表明circNFIB1抑制了胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[18]。熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)表明，circNFIB1主要位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)定位的circRNA主要作為ceRNA發(fā)揮作用，并參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[18]。Pull-down實(shí)驗(yàn)表明，在Capan-2和PANC-1細(xì)胞中，miR486-5p被circNFIB1富集；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，miR-486-5p過(guò)表達(dá)顯著降低了circNFIB1的熒光素酶活性；FISH分析也證實(shí)了circNFIB1和miR-486-5p在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中的共同定位，均提示circNFIB1靶向miR-486-5p發(fā)揮抑瘤作用[18]。進(jìn)一步研究表明磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)與miR-486-5p存在互補(bǔ)序列，二者在PDAC細(xì)胞中呈負(fù)性共表達(dá)[18]。PIK3R1是PI3K的受體單位，此前有報(bào)道稱其抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤進(jìn)展[19]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)是淋巴管生成所必需的，前期研究表明VEGF-C是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游調(diào)節(jié)因子，qRT-PCR分析顯示，胰腺癌細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)水平在circNFIB1被沉默后增加[18]。綜上，circNFIB1可通過(guò)海綿作用吸附miR-486-5p，進(jìn)而上調(diào)PIK3R1的表達(dá)水平，抑制PI3K/Akt通路，進(jìn)一步下調(diào)VEGF-C的表達(dá)，抑制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移[18]。

2.2 Hsa_circ_100 782 circRNA_100782定 位于chr11：33307958-33309057，序列長(zhǎng)度為1 099 nt[20]。Chen等[20]通過(guò)qRT-PCR研究了circRNA_100782在正常胰腺上皮細(xì)胞系(human pancreatic duct epithelial cells，HPDE)和BxPC3細(xì)胞系之間的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在BxPC3細(xì)胞中顯著高表達(dá)。在隨后的基因敲除實(shí)驗(yàn)中，利用siRNA沉默circRNA_100782，CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)表明circRNA_100782敲除BxPC3細(xì)胞系的增殖和集落形成能力顯著減弱，表明circRNA_100782是腫瘤細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)因子[20]。通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)miR-124具有circRNA_100782的結(jié)合位點(diǎn)[20]，既往有研究表明，miR-124通過(guò)靶向白細(xì)胞介素6受體(interleukin-6 receptor，IL6R)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在食管癌、肝細(xì)胞癌和胰腺癌等多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[21]。Western blot結(jié)果表明，IL6-JAK2-STAT3信號(hào)通路與胰腺癌的細(xì)胞增殖有關(guān)，STAT3主要受上游IL6R的調(diào)控，IL6R的激活促進(jìn)下游非受體型酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)蛋白磷酸化，磷酸化的JAK2蛋白進(jìn)一步活化下游STAT3，增強(qiáng)了細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-124通過(guò)直接靶向IL6R和STAT3的3’-UTR發(fā)揮作用，過(guò)表達(dá)的miR-124可顯著下調(diào)IL6R、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤增殖[21]。以上研究證實(shí)circRNA_100782能夠與miR-124結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而激活I(lǐng)L6R和STAT3，促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.3 circ_0030235 circ_0030235定 位 于chr13:49075877e49077050，基因符號(hào)為RCBTB2[22]。高通量circRNA微陣列結(jié)果顯示，與配對(duì)的非癌組織相比，circ_0030235在胰腺癌組織樣本中過(guò)表達(dá)[23]。Xu等[22]的研究表明，circ_0030235的表達(dá)水平與腫瘤分期(P=0.001)、淋巴結(jié)浸潤(rùn)(P=0.013)呈正相關(guān)，與患者的長(zhǎng)期預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P=0.010)[22]。CCK-8實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，circ_0030235被沉默后，PANC1細(xì)胞系的增殖和集落形成能力顯著下降，凋亡明顯增多[22]。進(jìn)一步研究表明，circ_0030235通過(guò)靶向miR-1253和miR-1294發(fā)揮促癌作用。在此前的研究中，miR-1253和miR-1294已被驗(yàn)證在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng)[22]。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-1253通過(guò)靶向Wnt5A抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和侵襲。Shi等[25]研究報(bào)道了miR-1294在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于相鄰正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)miR-1294通過(guò)靶向c-Myc抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上，circ_0030235作為miR-1253和miR-1294的分子海綿，下調(diào)二者在腫瘤組織中表達(dá)水平，減弱其抑癌效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.4 circRNA_000864 circRNA_000864在circBase中的代碼為hsa_circ_0000662，基因定位于chr16：398402-398484，基因組長(zhǎng)度為82 nt。Huang等[27]通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了circRNA_000864在59例胰腺癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，circRNA_000864在胰腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織(P＜ 0.05)，且與TMN分期有關(guān)。為了進(jìn)一步評(píng)估circRNA_000864是否影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，用oe-circRNA_000864質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AsPC-1細(xì)胞，使circRNA_000864表達(dá)增加，隨后的Transwell、流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降，凋亡增加[27]。circInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circRNA_000864與miR-361-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了二者的靶向關(guān)系[27]。EDU試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，用miR-361-3p模擬物轉(zhuǎn)染ASPC-1細(xì)胞系后，阻滯于G0/G1期的細(xì)胞比例下降，S期細(xì)胞的比例上升，細(xì)胞遷移和侵襲增多，凋亡減少，而oecircRNA_000864轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)[27]。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示miR-361-3p在胰腺癌細(xì)胞中與B細(xì)胞異位基因2(B-cell translocation gene 2，BTG2)有結(jié)合位點(diǎn)，可以與BTG2的3’-UTR區(qū)特異性結(jié)合[27]。在既往研究中，BTG2被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因，Huang等[28]報(bào)道過(guò)表達(dá)的BTG2可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感度；Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn)BTG2是miR-27a-3p在胃癌中的直接作用靶點(diǎn)，過(guò)表達(dá)的BTG2可觸發(fā)細(xì)胞G1/S期阻滯，誘導(dǎo)凋亡。

2.5 circ-ASH2L Chen等[30]通過(guò)對(duì)25組胰腺癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，circ-ASH2L在胰腺癌組織中的表達(dá)增高，并且與淋巴浸潤(rùn)、TNM分期和遠(yuǎn)期生存率顯著相關(guān)。CCK-8和Transwell試驗(yàn)表明，在胰腺癌細(xì)胞系Capan-1及AsPC-1中上調(diào)circ-ASH2L的表達(dá)可促進(jìn)其增殖和侵襲；流式細(xì)胞儀分析顯示，在AsPC-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circ-ASH2L后，停滯在G1期的細(xì)胞減少，在Capan-1細(xì)胞中，沉默circ-ASH2L可使更多的細(xì)胞被阻滯在G1期[30]。為了進(jìn)一步檢測(cè)circ-ASH2L在血管生成中的作用，用circ-ASH2L轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，與對(duì)照組相比，其管狀結(jié)構(gòu)的生成明顯增多[30]。使用miRanda工具對(duì)circ-ASH2L的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并進(jìn)行了qRTPCR分析，結(jié)果表明miR-34a是circ-ASH2L最可能的作用靶點(diǎn)，隨后的生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)[30]。已有研究報(bào)道m(xù)iR-34a可以通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1的表達(dá)，作用于P21、c-MET、SNAIL和VEGF信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)包括乳腺癌、胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移和血管生成[31-32]。Western blot實(shí)驗(yàn)表明，circ-ASH2L可以上調(diào)Capan-1和AsPC-1細(xì)胞Notch1的表達(dá)，而miR-34a可降低Notch1的表達(dá)，并且miR-34a所介導(dǎo)的抑制作用可以被circ-ASH2L所逆轉(zhuǎn)[30]。因此，circ-ASH2L通過(guò)作為miR-34a的ceRNA，靶向Notch1通路，調(diào)節(jié)P21、c-MET、SNAIL和VEGF的表達(dá)，最終促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和血管生成。

2.6 circ-ADAM9 Xing等[33]研究表明絲氨酸蛋白酶3(serine protease 3，PRSS3)在胰腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)顯著增加，并與腫瘤的侵襲性呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)Targetscan和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)PRSS3的3’-UTR與miR-217之間存在互補(bǔ)序列，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)表明，miR-217過(guò)表達(dá)顯著降低了野生型載體的熒光素酶活性，但對(duì)突變型載體的熒光素酶活性沒(méi)有影響，驗(yàn)證了PRSS3 3’-UTR中的“UGCAGU”序列是miR-217針對(duì)PRSS3的作用位點(diǎn)[33]。與鄰近正常組織相比，miR-217在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，并且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)，提示miR-217是腫瘤發(fā)生過(guò)程中一個(gè)重要的異常miRNA，其下調(diào)可能是導(dǎo)致PRSS3過(guò)表達(dá)的原因之一[33]。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，miR-217的敲除增加了PC細(xì)胞中PRSS3的表達(dá)，miR-217沉默的MiaPaca2細(xì)胞系表現(xiàn)出較對(duì)照細(xì)胞更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，并且這些效應(yīng)隨著PRSS3基因敲除而減弱[33]。RNA Pull-down分析和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明circ-ADAM9與miR-217關(guān)系密切，在胰腺癌組織中circ-ADAM9的表達(dá)明顯高于匹配的非癌組織，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)[33]。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，circ-ADAM9的過(guò)表達(dá)顯著提高了PRSS3的表達(dá)水平，并且這種現(xiàn)象可被miR-217的表達(dá)所抑制；相反，circ-ADAM9的敲除顯著降低了PRSS3的表達(dá)，而miR-217的缺失可以挽救這一現(xiàn)象[33]。此前已有研究表明PRSS3是一種促癌基因，能夠通過(guò)激活ERK/VEGF通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[34]。

2.7 circBFAR circBFAR在circBase中的代碼為hsa_circ_0009065，序列長(zhǎng)度為336 nt，由于其來(lái)源于BFAR基因外顯子2，被命名為稱為circBFAR[35]。Guo等[35]通過(guò)對(duì)6對(duì)胰腺癌樣本和匹配的癌旁正常組織樣本進(jìn)行微陣列分析，篩選出了20個(gè)可能存在異常表達(dá)的circRNA，之后在含有208例PDAC患者的隊(duì)列中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)只有circBFAR的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。集落形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，circBFAR能促進(jìn)體外腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組裸鼠相比，circBFAR基因敲除的裸鼠腫瘤重量和體積更小，Ki-67水平較低[35]。Pull-down實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)均表明miR-34b-5p是PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中唯一與circBFAR特異性結(jié)合的miRNA，qRT-PCR分析也進(jìn)一步證實(shí)，胰腺癌組織中miR-34b-5p的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，且與TNM分期呈負(fù)相關(guān)[35]。進(jìn)一步的研究表明，胰腺癌細(xì)胞中miR-34b-5p過(guò)表達(dá)和circBFAR敲低均顯著下調(diào)了間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal to epithelial transition factor，MET)的表達(dá)[35]。MET被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的酪氨酸激酶，在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，既往有研究表明，MET在胰腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起促進(jìn)作用[36]。Western blot結(jié)果表明，miR-34b-5p的過(guò)表達(dá)或circBFAR的敲除都顯著降低了MET及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化Akt(蛋白激酶B，PKB)的水平(Ser 473)，而對(duì)總Akt的水平無(wú)明顯影響[35]。因此，circBFAR通過(guò)作為miR-34b-5p的分子海綿，異常激活MET/Akt通路，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

2.8 circSFMBT1 circSFMBT1在circBase中的代碼為hsa_circ_0066147，序列長(zhǎng)度為234 bp，來(lái)源于SFMBT1基因第9~10外顯子[37]。Xu等[37]通過(guò)對(duì)32例胰腺腫瘤標(biāo)本和鄰近非腫瘤對(duì)照標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤樣本中的circSFMBT1和P21-激活激酶1(PAK1)水平顯著上調(diào)，而miR-330-5p水平下調(diào)，同樣的結(jié)果在4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1、AsPC-1、Capan1和BxPC-3)和HPDE中得到了印證。生物信息學(xué)分析(基于CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù))和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明circSFMBT1和miR-330-5p之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)[37]。以sh-circSFMBT1轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行基因敲除，結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染shNC的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞miR-330-5p的表達(dá)水平升高，細(xì)胞形成的集落數(shù)目減少，凋亡百分率升高，同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，敲除circSFMBT1顯著降低了胰腺癌細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白的水平，包括CyclinD1、c-Myc、Ki-67和Bcl-2，上調(diào)了凋亡相關(guān)蛋白的水平，如Bax[37]。進(jìn)一步的研究表明，miR-330-5p在PC細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低了PAK1的表達(dá)水平，通過(guò)生物信息學(xué)分析，初步確定了miR-330-5p和PAK1 mRNA之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)則直接證實(shí)了二者的相互作用[37]。PAK1是絲-蘇氨酸激酶家族的成員之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)等生物學(xué)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，先前的研究表明PAK1能夠促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，PAK1通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)和MET促進(jìn)乳腺癌的惡性轉(zhuǎn)變[38]。綜上，circSFMBT1作為miR-330-5p的分子海綿，下調(diào)miR-330-5p的表達(dá)，解除了其對(duì)PAK1信號(hào)通路的抑制，最終激活MAPK和MET，從而促進(jìn)了胰腺癌的增殖、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

2.9 circEIF6 circEIF6又被稱為circRNA真核起始因子6，在circBase中的代碼為hsa_circ_0060055[39]。Zhang等[39]通過(guò)對(duì)39例胰腺腫瘤組織及與之配對(duì)的癌旁正常組織進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中circEIF6的表達(dá)顯著增強(qiáng)，且與TNM分期呈正相關(guān)，在診斷實(shí)驗(yàn)中ROC曲線下面積(AUC)為0.909 3(95% CI：0.845～0.973 5)，表明circEIF6對(duì)于胰腺癌具有一定的診斷價(jià)值[39]。在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，用siRNA沉默circEIF6，結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染si-NC的對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力也受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡增加[39]。生物信息學(xué)檢測(cè)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明circEIF6與miR-557之間存在相互作用的靶點(diǎn)[39]。根據(jù)之前的報(bào)道，miR-557可以抑制胰腺癌和肺癌的發(fā)展。Yang等[40]的研究證明miR-557過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Zhang等[39]的研究表明，miR-557沉默可逆轉(zhuǎn)由于circEIF6敲除所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞的遷移和侵襲能力也提高，細(xì)胞凋亡減少。qRT-PCR和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示miR-557與溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)存在相互作用的靶點(diǎn)，在胰腺腫瘤組織中SLC7A11的表達(dá)高于癌旁正常組織，并且在兩種胰腺癌細(xì)胞系(Hs 766T和SW1990)中SLC7A11的表達(dá)水平也明顯高于HPDE，與miR-557的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與circEIF6的表達(dá)呈正相關(guān)[39]。miR-557過(guò)表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而SLC7A11轉(zhuǎn)染可減弱這些抑制作用，減少腫瘤細(xì)胞凋亡[39]。進(jìn)一步的研究表明，miR-557過(guò)表達(dá)下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中磷酸化蛋白激酶B(PKB，Akt)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的水平，而導(dǎo)入SLC7A11質(zhì)粒后，胰腺癌細(xì)胞中p-Akt/Akt和p-PI3K/PI3K水平基本恢復(fù)，提示miR-557通過(guò)靶向SLC7A11抑制了PI3K/Akt通路的活性和惡性潛能[39]。

3 結(jié)論

盡管目前用于胰腺癌診斷和治療的circRNA還處于研究起步階段，但已經(jīng)取得了一些初步的進(jìn)展，已有研究證實(shí)胰腺癌組織與癌旁組織的circRNAs的表達(dá)譜有顯著差異。進(jìn)一步研究表明，胰腺癌中的circRNAs可以通過(guò)與miRNAs結(jié)合，作用于不同的信號(hào)軸，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和化療耐藥等行為，識(shí)別這些信號(hào)通路可能為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。然而，目前尚缺乏強(qiáng)有力的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證據(jù)證實(shí)circRNAs在臨床診斷和治療中的確切作用，且circRNA在胰腺癌的發(fā)生和進(jìn)展中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。鑒于circRNA的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和廣泛功能，筆者認(rèn)為circRNA在胰腺癌的早期診斷和靶向治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。