間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多孔鉭治療骨關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展

李思雨，劉凱楠，王思涵，李粵源，崔逸爽，王 茜

華北理工大學(xué)，河北唐山 063200 1公共衛(wèi)生學(xué)院；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3臨床醫(yī)學(xué)院

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是常見的進(jìn)行性骨科疾病，累及身體多處部位，包括膝關(guān)節(jié)、腰椎、頸部、手部和髖關(guān)節(jié)等，其主要病理特征是軟骨損傷，伴有骨贅形成、關(guān)節(jié)間隙變窄和軟骨下硬化等，多發(fā)于中老年人群，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[1-2]。OA初期以保守治療為主，如理療[2]、藥物治療[3]和關(guān)節(jié)腔注射治療[4]等；晚期癥狀嚴(yán)重則需手術(shù)治療，如截骨術(shù)[5]和關(guān)節(jié)置換術(shù)[6]等。這些治療方法能暫時緩解癥狀，但無法徹底治愈，不能阻止軟骨進(jìn)一步退化，且手術(shù)創(chuàng)傷大，具有一定風(fēng)險(xiǎn)性。如今，組織工程學(xué)已廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，其包括使用種子細(xì)胞、生物相容性支架和適當(dāng)?shù)纳锘瘜W(xué)因子修復(fù)/替代器官或組織內(nèi)特定受損空間的所有程序[7-10]。多數(shù)研究者已經(jīng)確定間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cells，MSCs)作為種子細(xì)胞的優(yōu)勢[11-12]。傳統(tǒng)的生物材料支架往往難以兼具生物相容性和機(jī)械性能。近年來金屬材料中的多孔鉭(porous tantalum，PT)因其優(yōu)越的性能引起關(guān)注。本文就國內(nèi)外使用間充質(zhì)干細(xì)胞和(或)金屬材料PT治療OA的作用進(jìn)行綜述，旨在引起人們對其潛在機(jī)制的探索，提高對軟骨缺損與修復(fù)的認(rèn)識，為后期研究提供參考。

1 軟骨缺損修復(fù)的組織工程

近20年來，軟骨組織工程領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展，成為最有前途的軟骨組織重建治療策略。組織工程應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)原理，為受損組織或器官的再生提供了先進(jìn)的治療方案，主要包括三大要素，即種子細(xì)胞、生物支架材料和生物化學(xué)因子。

1.1 種子細(xì)胞 組織工程學(xué)促進(jìn)受損軟骨的修復(fù)和再生。種子細(xì)胞是軟骨組織工程所必需的，它決定著受損組織的功能再生程度。在軟骨組織工程中，種子細(xì)胞大多來源于軟骨細(xì)胞或多向分化潛能MSCs。

獲取軟骨組織具有很大的限制，常導(dǎo)致對患者的二次損傷，單一培養(yǎng)幾代之后，軟骨細(xì)胞多失去其自然表型并經(jīng)歷退化，導(dǎo)致無效的修復(fù)。MSCs具有來源豐富、易于獲取和體外擴(kuò)增迅速等其他細(xì)胞難以比擬的優(yōu)勢，成為軟骨組織工程中首選的“種子細(xì)胞”。

早在1968年，F(xiàn)riedenstein等[13]在骨髓中發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞/前體細(xì)胞。在后續(xù)的研究中，Caplan[14]將這些細(xì)胞進(jìn)一步命名為“mesenchymal stem cells”。目前MSCs已成為促進(jìn)軟骨修復(fù)的研究熱點(diǎn)。多種基礎(chǔ)研究已表明OA與MSCs的功能退化和衰老有關(guān)。Krüger等[15]研究發(fā)現(xiàn)OA患者M(jìn)SCs的增殖能力和分化潛能降低。?amernik等[16]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性O(shè)A的病理多伴有MSCs衰竭。Markides等[17]研究表明，綿羊骨軟骨缺損模型中自體MSCs的歸巢能力有限。此外，針對MSCs治療OA的臨床研究也取得一定進(jìn)展。Song等[18]收集了使用MSCs治療膝OA的臨床試驗(yàn)(2019年4月之前)，包括隨機(jī)對照試驗(yàn)、回顧性研究和隊(duì)列研究，對MSCs治療膝OA的有效性和安全性進(jìn)行評估，結(jié)果顯示，與對照組相比，MSCs治療可以顯著降低視覺模擬評分以及安大略省西部大學(xué)和麥克馬斯特大學(xué)的OA指數(shù)評分。Emadedin等[19]通過一項(xiàng)隨機(jī)、三盲、安慰劑對照的隨機(jī)對照試驗(yàn)證實(shí)了關(guān)節(jié)內(nèi)植入自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的安全性和有效性。提示MSCs已經(jīng)應(yīng)用于OA的治療，并顯示出良好的結(jié)果和巨大的應(yīng)用前景。

MSCs可能通過以下機(jī)制修復(fù)或再生軟骨。1) MSCs多能分化潛能：MSCs能夠分化為中胚層譜系的細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。多種細(xì)胞因子的添加和支架的共培養(yǎng)可以促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞分化。TGF-β已成為誘導(dǎo)多種干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化以及修復(fù)軟骨組織不可缺少的成分。Fang等[20]發(fā)現(xiàn)TGF-β可以促進(jìn)Smad2的磷酸化及其核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)軟骨標(biāo)志物SOX9、α-Acan和Ⅱ型膠原的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Frisch等[21]使MSCs高表達(dá)TGF-β，結(jié)果顯示軟骨形成標(biāo)志物(如SOX9和Ⅱ型膠原)的表達(dá)升高，再次證實(shí)TGF-β促進(jìn)MSCs的軟骨向分化。2)MSCs歸巢作用：MSCs歸巢是治療OA的重要環(huán)節(jié)，其過程可以歸納為MSCs在組織的血管系統(tǒng)內(nèi)停滯，隨后跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移[22]。這一過程是極其復(fù)雜的，黏附分子、趨化因子受體和金屬蛋白酶分子類別的酶的表達(dá)和功能對于MSCs從外周血運(yùn)輸?shù)教囟ǖ陌衅鞴偈潜夭豢缮俚腫23]。體外擴(kuò)增培養(yǎng)的MSCs可高表達(dá)某些介導(dǎo)歸巢的細(xì)胞黏附分子(如α4、α5和α1整合素等)，低水平表達(dá)或缺失其他相關(guān)的黏附和趨化因子受體(如PSGL-1和CXCR4)[24]。3)MSCs的免疫學(xué)作用：首先，MSCs具有低免疫原性和較低的抗原提呈能力[23,25-26]；其次，MSCs能夠?qū)Χ喾N免疫細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，直接抑制T細(xì)胞的激活或增殖并誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，影響抗原提呈細(xì)胞的分化、成熟和功能，從而使其轉(zhuǎn)化為抑制性或耐受性表型[27]。此外，MSCs的主要潛力在于旁分泌功能，可通過分泌細(xì)胞因子間接介導(dǎo)免疫細(xì)胞，包括免疫調(diào)節(jié)因子、抗炎因子和趨化因子，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[28-30]。目前MSCs的免疫抑制作用已得到證實(shí)，并取得了一定的臨床治療效果，但MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用受諸多因素的影響，如何調(diào)控MSCs的免疫調(diào)節(jié)仍然需要進(jìn)一步研究。

1.2 生物材料支架 “種子細(xì)胞”活性對功能性軟骨組織的再生起著關(guān)鍵作用。然而，在沒有合適支架的情況下加工處理種子細(xì)胞MSCs過程中往往會出現(xiàn)肥大、退化等不良變化，阻礙軟骨組織工程的發(fā)展。目前常見的骨軟骨生物支架材料包括天然生物材料支架和人工合成材料支架等。天然生物支架材料主要包括膠原、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽和富含血小板的纖維蛋白等[31-32]。當(dāng)海藻酸鹽微球和透明質(zhì)酸水凝膠結(jié)合時，可作為MSCs和轉(zhuǎn)化生長因子的復(fù)合載體，并保持其在支架中的生物活性，促進(jìn)MSCs的軟骨形成[33]。人工合成支架材料主要包括磷酸三鈣、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)等[34]。Han等[35]在兔體內(nèi)植入軟骨源性MSCs/PLAPGA復(fù)合物支架復(fù)合材料12周后，膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損處成功再生透明樣軟骨，其組織學(xué)和力學(xué)特性與正常軟骨類似，組織學(xué)檢查顯示界面愈合良好，軟骨下骨附著良好。雖然天然支架材料具有良好的生物相容性，但機(jī)械性能卻較差；人工合成支架材料則存在生物相容性欠佳等問題。

金屬材料是骨科最早采用的生物材料，廣泛適用于關(guān)節(jié)系統(tǒng)的修復(fù)。金屬本身并不具備一定的生物功能，但可以通過對金屬表面進(jìn)行化學(xué)改性或用其他生物功能材料包覆來制備基于金屬的生物功能材料[36]。PT是一種難熔金屬，具有很高的導(dǎo)熱性和導(dǎo)電性，孔隙率為75%～85%，與人類骨松質(zhì)的孔隙率一致，其保護(hù)性氧化物表面使其具有高度耐腐蝕性，并且在動物和人體中具有很高的生物相容性和生物活性，是一種理想的醫(yī)用生物材料[37-38]。值得注意的是，PT的高度耐腐蝕性對置入物的壽命有重要意義，避免了在人體載荷和運(yùn)動模式下，置入物與軟骨接觸面發(fā)生摩擦腐蝕導(dǎo)致的置入物松動，同時也避免了摩擦腐蝕時釋放的金屬離子對機(jī)體造成嚴(yán)重傷害。此外，PT良好的彈性模量對載荷應(yīng)力均勻分布到鄰近骨組織、減小應(yīng)力屏蔽效應(yīng)、顯著減少或消除骨丟失具有重要意義[39]。正是因?yàn)檫@些特性，PT可廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和骨軟骨組織工程。Piglionico等[40]研究結(jié)果表明PT可以促進(jìn)MSCs進(jìn)一步黏附、分化和擴(kuò)散，證明PT的生物相容性。尉曉蔚等[41]研究發(fā)現(xiàn)置入膠原膜/國產(chǎn)PT金屬雙相支架16周后，幾乎半個股骨頭的骨軟骨缺損修復(fù)成功。張輝等[42]研究表明PT復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白7對軟骨及軟骨下骨缺損的修復(fù)有良好作用。Mardones等[43]研發(fā)了一種類似于骨軟骨塞的兔骨膜/PT復(fù)合材料，在軟骨基質(zhì)中培養(yǎng)6周后，骨膜纖維層牢固附著在PT支架上，形成層背向鉭層，并形成透明狀軟骨組織。Wang等[44]將骨形態(tài)發(fā)生蛋白7/PT復(fù)合材料置入兔骨軟骨缺損區(qū)，發(fā)現(xiàn)PT與宿主骨界面上出現(xiàn)新的軟骨和骨細(xì)胞并逐漸增多，新形成的骨小梁開始長入孔隙中，骨組織逐漸與PT結(jié)合，缺損區(qū)在16周內(nèi)恢復(fù)。Kamal等[45]將以纖維蛋白為軟骨細(xì)胞載體的PT支架置入小鼠背部，發(fā)現(xiàn)該支架可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和軟骨組織形成，具有治療軟骨缺損的潛力。以上均提示PT可以很好地應(yīng)用于骨軟骨組織工程中，這種疏松多孔的結(jié)構(gòu)有利于組織細(xì)胞的生長增殖，對細(xì)菌有較低的黏附力，已經(jīng)應(yīng)用于臨床并取得良好的效果，根據(jù)患者不同的要求，其所需的物理特性往往不同，可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整[46]。

2 MSCs復(fù)合PT在軟骨組織工程中的應(yīng)用

多數(shù)研究者采用MSCs與PT復(fù)合培養(yǎng)修復(fù)軟骨缺損。Blanco等[10]研究表明PT復(fù)合培養(yǎng)MSCs可提高細(xì)胞活力，并且保留了它們的免疫表型和分化模式，同時能夠輸送MSCs，而不會導(dǎo)致分化能力的喪失，這將支持這種組合應(yīng)用于臨床研究，特別是脊柱融合程序和重建技術(shù)研究。Smith等[47]研究表明一定條件下MSCs在PT中具有良好的黏附和增殖能力，在共聚焦和掃描電鏡下可以看到細(xì)胞穿透深度超過5 mm，表明這種大孔三維結(jié)構(gòu)適合于細(xì)胞增殖，力學(xué)測試證實(shí)，在PT中加入MSCs顯著增強(qiáng)了其界面強(qiáng)度，并與培養(yǎng)樣品中大量產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的情況一致?？傊?，PT對MSCs正常的生理功能無抑制作用，并在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和黏附，提示MSCs與PT的相互作用結(jié)果良好。此外，多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)PT復(fù)合MSCs培養(yǎng)對軟骨缺損的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。崔逸爽等[48]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs與PT體外復(fù)合培養(yǎng)后可正常生長、增殖，證實(shí)PT無細(xì)胞毒性，有良好的生物相容性；與單純軟骨誘導(dǎo)組相比，添加PT支架的BMSCs軟骨分化程度增加。Liu等[49]將PT復(fù)合Bio-Gide膠原膜與MSCs體外共培養(yǎng)，置入缺損區(qū)修復(fù)全層關(guān)節(jié)缺損，術(shù)后12周，缺損邊緣附近的PT上可見新的軟骨組織的形成，這種組織具有高質(zhì)量的成分和結(jié)構(gòu)，其質(zhì)量與天然透明軟骨相似。Wei等[50]研究證實(shí)PT可促進(jìn)BMSCs的黏附和生長，并構(gòu)建山羊骨軟骨缺損模型，置入BMSCs負(fù)載的PT復(fù)合仿生三維膠原支架，16周后成功修復(fù)近一半股骨頭的骨軟骨缺損。大多數(shù)研究集中于純鉭或鉭合金置入物上，這些置入物價格昂貴且來源稀少，不利于廣泛應(yīng)用，采取將鉭涂層等離子噴涂到其他金屬表面上的策略，可以提高金屬置入物的生物相容性。Wang等[51]利用鉭涂層多孔鈦支架與兔BMSCs復(fù)合構(gòu)建組織工程化人造椎體，結(jié)果表明，與單獨(dú)多孔鈦支架相比，在鉭涂層支架表面，BMSCs偽足與支架結(jié)合更緊密，具有更好的增殖能力和成骨效果，并且更好地促進(jìn)了兔腰椎缺損的修復(fù)?；蛟S鉭涂層金屬材料的復(fù)合支架會為軟骨組織工程提供一個新的研究思路。

3 結(jié)語

一個相對較新的領(lǐng)域——軟骨組織工程已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。目前國際多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)可MSCs為組織工程中最佳的種子細(xì)胞，但尚無統(tǒng)一認(rèn)可的生物支架材料。PT與MSCs的復(fù)合培養(yǎng)通過修復(fù)軟骨缺損治療OA的方法已經(jīng)展示出研究價值，但PT促進(jìn)MSCs修復(fù)軟骨缺損的具體機(jī)制仍未明確，多數(shù)實(shí)驗(yàn)仍處于動物或體外實(shí)驗(yàn)階段，未來還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。此外，由于PT較稀少且昂貴，未來的研究需要尋找便捷簡易的制備方法，保證積極的生物效應(yīng)，同時應(yīng)用表面修飾技術(shù)對PT的性能進(jìn)行優(yōu)化，包括誘導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖及組織形成能力。