微小RNA、長鏈非編碼RNA及二者相互作用調(diào)控成骨細(xì)胞功能的研究進(jìn)展

王藝璇，王 可，張 舒

空軍軍醫(yī)大學(xué) 航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710032

成骨細(xì)胞起源于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是新骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，對骨骼的生長和維持至關(guān)重要。成骨細(xì)胞在許多骨疾病，特別是在骨質(zhì)疏松癥、骨發(fā)育不良和原發(fā)性骨腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[1]。在骨組織中，骨形成取決于成熟成骨細(xì)胞的數(shù)量和功能，與成骨細(xì)胞的形成、壽命和活性密切相關(guān)。而成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性均由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳機(jī)制控制，并受到激素、機(jī)械應(yīng)力和細(xì)胞間相互作用等方式調(diào)節(jié)[2-4]。

人類基因組中只有1% ～ 2%的基因可編碼蛋白質(zhì)，其余98%曾被認(rèn)為是“垃圾”DNA，然而越來越多的特異性非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)被認(rèn)為是某些生物學(xué)過程的關(guān)鍵性調(diào)控因子，包括調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、染色質(zhì)重塑和表觀遺傳修飾等[5]。ncRNAs中有一部分是管家ncRNA(house-keeping non-coding RNA)，包 括核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、胞質(zhì)小RNA和核內(nèi)小RNA等，這些RNA分子直接或間接參與蛋白質(zhì)的表達(dá)。大部分ncRNA則是在一定條件下誘導(dǎo)表達(dá)，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，因而被稱為調(diào)節(jié)性ncRNA(regulatory non-coding RNA)，依據(jù)分子大小可分為短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼RNA[5]。短鏈非編碼RNA分子小于50 nt，主要分為微小RNA(microRNAs，miRNAs)、內(nèi)源性小干擾RNAs(endo-siRNAs)和PIWI相互作用RNAs(piRNAs)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)則主要指分子大于200 nt的調(diào)節(jié)性非編碼RNA。microRNAs和lncRNAs在成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)基因表達(dá)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其相關(guān)研究較多也較為深入，本文就近年來microRNAs、lncRNAs及其相互作用調(diào)控成骨細(xì)胞功能的研究進(jìn) 行綜述。

1 microRNAs調(diào)控成骨細(xì)胞功能

microRNAs是長度為22 nt左右(18 ～ 25 nt)的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過與特定信使RNA 3’UTR區(qū)結(jié)合形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)其降解或抑制其翻譯[6]。哺乳動(dòng)物miRNAs的合成受到精細(xì)的調(diào)控，一般來說是在RNA聚合酶Ⅱ催化作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生miRNA的初級(jí)前體(pri-miRNAs)，經(jīng)RNAseⅢ酶Drosha和pri-miRNA結(jié)合蛋白DGCR8組成的微處理器加工為具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體miRNAs(premiRNAs)，然后通過輸出蛋白(exportin 5)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNAs被Dicer切割為成熟的RNA雙鏈，與AGO蛋白結(jié)合，將特定的miRNA鏈整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物中，進(jìn) 而靶向調(diào)節(jié)靶基因mRNA表達(dá)[7]。

1.1 microRNAs在成骨分化過程中的改變 成骨細(xì)胞的分化過程以成骨細(xì)胞特異基因的順序激活為標(biāo)志，經(jīng)過細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、成熟和礦化后，一部分走向凋亡，另一部分則被周圍礦化基質(zhì)包埋形成骨細(xì)胞。在成骨細(xì)胞分化過程中，眾多miRNAs的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變。Oskowitz等[8]研究發(fā)現(xiàn)如果抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)中miRNAs的合成，其成骨分化能力減弱，并發(fā)現(xiàn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中有19個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)。Gong等[9]通過Satb2誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)了miR-27a等10個(gè)下調(diào)的miRNAs及miR-17等18個(gè)上調(diào)的miRNAs，生物信息學(xué)分析顯示這些miRNAs的靶基因參與了多條成骨分化通路，與骨形成及骨骼發(fā)育密切相關(guān)。而通過BMP2誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中有22個(gè)miRNAs表達(dá)發(fā)生了顯著變化，且其中具有代表性的miR-133和miR-1 35均可促進(jìn)骨形成[10]。

1.2 microRNAs調(diào)控成骨細(xì)胞分化 成骨細(xì)胞分化過程中，miRNAs表達(dá)發(fā)生改變，且在成骨細(xì)胞分化基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Runx2是成骨細(xì)胞分化的主開關(guān)，可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中ColⅠ、ALP和骨橋素等多個(gè)分化相關(guān)基因的表達(dá)，miR-433、miR-103a、miR-628-3p、miR-155、miR-204、miR-205-5p、miR-505和miR-30家族等可以降低間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)及成骨細(xì)胞中Runx2的表達(dá)并抑制成骨分化[11-18]。成骨細(xì)胞分化過程還受到骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號(hào)的調(diào)節(jié)，miR-542-3p、miR-98可分別靶向抑制BMP-7及BMP-2[19-20]，miR-222-3p、miR-155、miR-106b-5p和miR-17-5p則可通過特異性阻礙Smad5的翻譯中斷BMP信號(hào)通路，從而導(dǎo)致成骨抑制[21-23]。同時(shí)部分miRNAs可通過靶向成骨分化過程中的一些關(guān)鍵基因抑制成骨細(xì)胞分化，如miR-637靶向Osterix[24]、miR-186靶向SIRT6[25]、miR-143靶向k-RAS[26]、miR-3 077-5p和miR-705靶向HOXA10[27]，miR-214抑制ATF4和成纖維細(xì)胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1)[28-29]。另有研究表明，miRNAs不僅可以通過靶向成骨因子抑制成骨細(xì)胞分化，還可通過靶向成骨抑制因子促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)是一種特殊的蛋白質(zhì)，能夠負(fù)向調(diào)控Runx2等基因的表達(dá)，并可受到miRNAs調(diào)控[30]。miR-449a可抑制成骨細(xì)胞HDAC1的表達(dá)，維持組蛋白乙?；癄顟B(tài)，刺激Runx2基因表達(dá)[31]。miR-233可抑制小鼠MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中的HDAC-2表達(dá)，miR-873-3p可抑制大鼠成骨細(xì)胞UMR106-01中HDAC4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[32-33]。miR-143則可通過抑制HDAC7促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，且可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-143可有效改善骨質(zhì)丟失及老年性骨質(zhì)疏松[34]。BMP途徑的下游調(diào)節(jié)因子Smad 1、Smad 5、Smad 6和Smad 7可結(jié)合Smad泛素調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor-1，Smurf-1)誘導(dǎo)E3泛素連接酶依賴性蛋白降解[35]。miR-590-5p通過靶向Smad7，miR-503、miR-15b和miR-17則通過靶向Smurf-1，間接保護(hù)Runx2降解減少而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[36-39]。Hsc70相互作用蛋白/STIP1同源性的C末端和含有蛋白1的U-Box(CHIP/STUB1)可通過促進(jìn)Runx2蛋白降解而負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞分化，miR-764-5p則可抑制CHIP蛋白翻譯而促進(jìn)成骨分化[40]。He等[41]研究發(fā)現(xiàn)，miR-20b可通過抑制PPARγ、Bambi和Crim1在多個(gè)階段激活BMPs/Runx2信號(hào)通路而促進(jìn)成骨。miR-335-5p則可通過下調(diào)Dickkopf相關(guān)蛋白1上調(diào)β-catenin表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)成骨分化[42]。另有一項(xiàng)研究表明，miR-29b對成骨分化具有正性調(diào)控作用，可直接下調(diào)已知的成骨細(xì)胞分化抑制因子HDAC4、TGF-β3和ACVR2A等，并可抑制膠原合 成，促進(jìn)骨質(zhì)礦化[43]。

1.3 microRNAs調(diào) 控 成 骨 細(xì) 胞 增 殖 和 凋 亡 miRNAs同時(shí)也能調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和凋亡[44]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[45-46]。microRNA-23a則可通過調(diào)節(jié)Fas的表達(dá)，抑制小鼠成骨細(xì)胞凋亡[47]。相反，miR-182可通過抑制FoxO1減少成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[48]。Wei等[49]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b/c基因敲除小鼠模型中成骨細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-34b/c通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1積累來抑制成骨細(xì)胞的增殖。miR-542-3p的過表達(dá)則可通過抑制BMP-7及其下游PI3K/survivin通 路促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[19]。

2 lncRNAs調(diào)控成骨細(xì)胞功能

lncRNAs是長度超過200 nt的非編碼RNA，大多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，具有mRNA的結(jié)構(gòu)特征(5’帽式結(jié)構(gòu)和3 ’polyA尾)，但沒有長閱讀框架。lncRNAs可以定位于胞核和胞質(zhì)中，通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。定位于細(xì)胞核的lncRNAs，主要參與蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控等；而定位于細(xì)胞質(zhì)的lncRNAs，則主要參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控過程，尤其是 與microRNAs相互調(diào)控[5]。

2.1 lncRNAs在成骨分化過程中的改變 通過高通量技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在成骨分化過程中表達(dá)發(fā)生改變。Zuo等[50]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2誘導(dǎo)分化過程中有116個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，并發(fā)現(xiàn)了24對lncRNAs和附近的mRNAs協(xié)同差異表達(dá)。Qiu等[51]在hBMSCs的成骨分化中發(fā)現(xiàn)433個(gè)持續(xù)上調(diào)和232個(gè)持續(xù)下調(diào)的lncRNAs。Song等[52]在MSC成骨分化過程中發(fā)現(xiàn)574個(gè)lncRNAs的表達(dá)發(fā)生顯著改變，其中TCONS_00046478、TCONS_00027225和TCONS_00007697可能作為miR-689、miR-544和miR-640的前體調(diào)控共表達(dá)基因(Col4A4、Col21A1和WNT2)在成骨分化中發(fā)揮作用。Wang等[53]在hBMSCs成骨分化過程中的lncRNAs微陣列分析鑒定出1 206個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中H19和uc022axw.1可能在成骨過程中起重要作用。Zhang等[54]認(rèn)為MSC成骨分化過程中1 408個(gè)差異表達(dá)明顯的lncRNAs中有6個(gè)核心調(diào)控因子(NR_024031、XR_111050、FR148647、FR406817、FR401275和FR374455)，且XR_111050具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的潛能。Xie等[55]研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者骨髓MSC較正常人MSC具有更強(qiáng)的成骨分化能力，微陣列分析結(jié)果顯示有520個(gè)差異表達(dá)明顯的lncRNAs，其中l(wèi)nc-ZNF354A-1、lnc-LIN54-1、lnc-FRG2C-3和lnc-USP50-2可能參與了強(qiáng)直性脊柱炎患者骨髓MSC的成骨分化異常。在其他類型的細(xì)胞中，如人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)、人脂肪干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)和小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1中，同樣發(fā)現(xiàn) 成骨分化過程中l(wèi)ncRNAs表達(dá)的顯著差異[56-59]。

2.2 lncRNAs調(diào)控成骨細(xì)胞分化 在成骨細(xì)胞中，目前研究較多的是lncRNAs對成骨分化的調(diào)控作用[60-61]。在轉(zhuǎn)錄水平，Tang等[62]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs中l(wèi)ncRNA OG可與異質(zhì)核核糖核蛋白K蛋白相互作用激活BMP信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化。Jin等[63]發(fā)現(xiàn)在hASCs中l(wèi)ncRNA MIR31HG可以直接與IκBα相互作用，參與NF-κB的活化。敲除MIR31HG基因不僅能顯著促進(jìn)成骨分化，還能顯著緩解炎癥誘導(dǎo)的hASCs成骨抑制作用。在老齡化研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA Bmncr可以調(diào)節(jié)BMSCs的命運(yùn)。Bmncr作為促進(jìn)TAZ和ABL蛋白相互作用的支架，可以促進(jìn)TAZ和Runx2/pPARG轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化并抑制脂肪生成[64]。而在成骨相關(guān)疾病的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者的hBMSCs成骨分化受到抑制，lncRNA MEG3表達(dá)降低。MEG3通過直接影響SOX2活性而激活BMP4的轉(zhuǎn)錄活性，基因敲除MEG3可顯著降低成骨標(biāo)志物Runx2等的表達(dá)[65]。lncRNAs也可以在表觀遺傳水平調(diào)控成骨分化，尤其是通過組蛋白修飾影響基因表達(dá)。EZH2可以通過催化靶基因啟動(dòng)子組蛋白H3K27的甲基化抑制靶基因的表達(dá)。lncRNA HoxA-AS3和lncRNA ANCR均可與EZH2結(jié)合引起H3K27甲基化，抑制MSCs中Runx2的表達(dá)，進(jìn)而抑制成骨分化[66-67]。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs可以通過組蛋白乙?；揎棸谢?，如lncRNA AK141205和lncRNA-HIF1α-AS1可以分別通過促進(jìn)CXCL13、HoxD10啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H4的乙?；险{(diào)其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[68-69]。而在轉(zhuǎn)錄后水平，尤其是lncRNAs和microRNAs相互調(diào)控進(jìn)而影響成骨細(xì)胞功能的研究目前較多也較為成熟，下 文將進(jìn)行重點(diǎn)闡述。

2.3 lncRNAs調(diào)控成骨增殖和凋亡 lncRNAs同樣可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和凋亡。lncRNA DANCR在hBMSCs中的表達(dá)減少，可通過p38絲裂原活化蛋白激酶途徑抑制成骨細(xì)胞增殖[70]。在hPDLSCs中抑制lncRNA ANCR表達(dá)，可抑制GSK3β表達(dá)，激活Wnt通路促進(jìn)其增殖[71]。在MC3T3-E1細(xì)胞中，lncRNA Crnde也可以通過Wnt通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[72]。而去卵巢骨質(zhì)疏大鼠成骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AK023948表達(dá)明顯增多，通過調(diào)節(jié)AKT磷酸化水平抑制成骨細(xì)胞增殖[73]。此外，重力敏感的lncRNA ODSM在MC3T3-E1細(xì)胞 中不僅能促進(jìn)成骨分化，也能抑制其凋亡[74]。

3 microRNAs和lncRNAs相互作用調(diào)控成骨細(xì)胞功能

競爭性內(nèi)源性RNAs (competitive endogenous RNAs，ceRNAs)假說是一種重要的功能模式，lncRNAs可通過與miRNAs相互作用作為ceRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這類lncRNAs亦被稱為miRNA海綿[75]。這類lncRNAs包含一個(gè)或多個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，并通過吸附miRNAs減少其與靶mRNA的結(jié)合或加速其降解。反過來，miRNAs也可以與lncRNAs通過AGO2途徑結(jié)合調(diào)節(jié)1ncRNAs的表達(dá)水平。

目前研究發(fā)現(xiàn)microRNAs和lncRNAs可以相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PGC1β-OT1可以通過拮抗miR-148a-3p促進(jìn)賴氨酸特異性脫甲基酶6b(KDM6B)的表達(dá)，MCF2L-AS1也可通過結(jié)合miR-33a促進(jìn)Runx2表達(dá)，LOC100506178和lncRNA Rhno1可分別與miR-214-5p和miR-6 979-5p結(jié)合促進(jìn)BMP2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[76-79]。Linc-ROR同樣可以通過結(jié)合miR-138和miR-145，促進(jìn)ZEB2的表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/β-catein通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[80]。牙周炎患者h(yuǎn)PDLSCs中l(wèi)ncRNA-POIR表達(dá)下降，與miR-182相互抑制，形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)FoxO1表達(dá)，促進(jìn)hPDLSCs向成骨分化[81]。在hASCs的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA-HIF1A-AS2、lncRNA-PCAT1可分別吸附miR-665和miR-45-5p，促進(jìn)ASC成骨分化[82-83]。Linc02349作為miR-25-3p和miR-33b-5p的分子海綿可分別調(diào)控SMAD5和Wnt10b的表達(dá)，激活Dlx5/OSX途徑，從而促進(jìn)人臍帶源性干細(xì)胞向成骨分化[84]。在MC3T3-E1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)lncRNA OGRU可通過競爭性結(jié)合miR-320促進(jìn)Hoxa10蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[85]。相反的，Yang等[86]在骨質(zhì)疏松患者的骨組織中及去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的BMSC和骨組織中觀察到lncRNA-ORLNC1表達(dá)升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ORLNC1可以作為ceRNA結(jié)合miR-296，影響靶基因Pten的表達(dá)，抑制成骨分化。骨質(zhì)疏松患者血清中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)顯著減少，體外研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19可以通過下調(diào)miR-19b-3p表達(dá)而顯著抑制BMSCs細(xì)胞增殖和成骨分化[87]。在小鼠MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中，miR-139-3p可以抑制成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，并且可以與lncRNA ODSM相互調(diào)控[88]。而lncRNA KCNQ1OT1可以與miR-701-3p相互作用，通過調(diào)控FGFR3表達(dá)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、遷移，減少凋亡[89]。Bu等[90]發(fā)現(xiàn)lncRNA TSIX可以負(fù)性調(diào)節(jié)miR-30a-5p表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。此外，He等[91]研究發(fā)現(xiàn)miR-141可以通過下調(diào)lncRNA H19和miR-675的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。

lncRNAs還可作為具有miRNAs的前體分子發(fā)揮調(diào)控功能。Huang等[92]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19外顯子可以編碼miR-675，抑制TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)，減少Smad3的磷酸化水平，進(jìn)而通過下調(diào)組蛋白去乙?；?/5的表達(dá)，增加成 骨標(biāo)志基因Runx2等的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化。

4 結(jié)語

綜上所述，microRNAs和lncRNAs在成骨細(xì)胞中構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以調(diào)控成骨細(xì)胞功能，影響骨形成，對骨穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。然而目前仍有一些問題需要解決，如成骨細(xì)胞中不同microRNAs和lncRNAs相互作用的研究較少，成骨細(xì)胞眾多發(fā)揮作用的ncRNA中最為關(guān)鍵的分子尚不十分明確。進(jìn)一步研究應(yīng)闡明成骨細(xì)胞中microRNAs和lncRNAs的作用機(jī)制，探尋其關(guān)鍵通路和靶點(diǎn)，可以更好地幫助研究骨質(zhì)疏松、骨發(fā)育不良等疾病的發(fā)病機(jī)制，并可能為這些疾病提供新的治療藥物。