口咽鱗狀細(xì)胞癌中人乳頭狀瘤病毒精準(zhǔn)檢測(cè)研究進(jìn)展

李志鵬 范志偉 王文龍 卜祥斌 張凌楠 馬向瑞

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東 濱州 256603 1 附屬醫(yī)院口腔頜面外科； 2 口腔醫(yī)學(xué)院； 3 附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科； 4 附屬醫(yī)院口腔正畸科)

口咽部位于軟腭和會(huì)厭上緣平面之間，借咽峽通向口腔，主要解剖結(jié)構(gòu)包括軟腭、舌根(界溝后1/3)、咽側(cè)壁、咽后壁以及扁桃體等[1]。2017年第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)[2]中TNM分期將口咽鱗狀細(xì)胞癌(OPSCC)按照有無(wú)人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染分為HPV相關(guān)性鱗狀細(xì)胞癌(OPSCC-HPV)和非OPSCC-HPV。近年來(lái)OPSCC發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，主要?dú)w因于高危型HPV的感染，尤其是HPV16[3]。2018年，美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)建議把HPV檢測(cè)作為診斷OPSCC的一項(xiàng)輔助檢查[4]。由于人種差異以及文化背景和生活方式不同，各個(gè)國(guó)家OPSCC患者HPV的感染率不同，我國(guó)OPSCC患者HPV的感染率低于20%,而北美地區(qū)約為56%，歐洲地區(qū)為17%～39%[5]。不同地區(qū)人群HPV感染率不同，推薦的檢測(cè)方法也不相同。如果完全按照國(guó)外相關(guān)指南或者共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)化我國(guó)檢測(cè)方案，將會(huì)使我國(guó)OPSCC-HPV的檢出率出現(xiàn)較大差異。因此本文就HPV的分子特性及其獨(dú)特生物分子標(biāo)志物檢測(cè)現(xiàn)狀做一總結(jié)，以求進(jìn)一步探索OPSCC-HPV更加特異和靈敏的檢測(cè)方法。以供實(shí)驗(yàn)室或臨床借鑒。

1 HPV

HPV在頭頸部的研究始于1901年，當(dāng)時(shí)描述了疣狀病變通過(guò)口交進(jìn)入口腔并進(jìn)行傳播[6]。隨后大量的研究結(jié)果證明HPV與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)，尤其是與OPSCC的發(fā)生密切相關(guān)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)分別在2007年和2012年正式調(diào)查并分析了HPV對(duì)人類的相關(guān)影響，并得到了足夠的證據(jù)表明口咽部確實(shí)存在HPV16感染后的致癌性[7]。

HPV是一種無(wú)包膜雙鏈DNA病毒，大約有8 000個(gè)堿基對(duì)，包括200多種亞型，廣泛感染人類上皮細(xì)胞并引起尋常疣、尖銳濕疣、宮頸癌、肛門癌和口咽癌等疾病[8]。根據(jù)與宮頸癌的關(guān)系，HPV類型被分為高風(fēng)險(xiǎn)(HPV 16、18、31、33和35型等)和低風(fēng)險(xiǎn)(HPV 26、30、34以及53型等)兩種類型[9]。高風(fēng)險(xiǎn)HPV(尤其是16、18型)可極大地促進(jìn)相關(guān)腫瘤的發(fā)生，特別是宮頸鱗狀細(xì)胞癌以及一些其他的生殖器惡性腫瘤等[9]。HPV可以分為3個(gè)部分：①早期區(qū)包含7個(gè)開放閱讀框(E1～E7)，于病毒感染早期表達(dá)，并在病毒的復(fù)制、免疫逃逸和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用；②晚期區(qū)(L)編碼衣殼蛋白L1和L2，該類蛋白參與病毒的包裝和釋放；③長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)作為調(diào)控元件參與病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[10]。當(dāng)人體感染HPV后，E6與腫瘤抑制蛋白P53結(jié)合，并通過(guò)蛋白酶介導(dǎo)途徑抑制P53的表達(dá)，進(jìn)而抑制其促凋亡功能；E7與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(PRb)結(jié)合，下調(diào)PRb進(jìn)而促進(jìn)P16的表達(dá)，使相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子無(wú)法控制細(xì)胞分裂，從而使細(xì)胞增殖失控，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11-12]。當(dāng)然，HPV的致癌機(jī)制遠(yuǎn)非經(jīng)典途徑如此簡(jiǎn)單。GILLISON等[12]最近研究發(fā)現(xiàn)，HPV促癌蛋白會(huì)引起宿主基因(凋亡基因、細(xì)胞增殖基因和免疫基因等)的不穩(wěn)定性，形成區(qū)別于非OPSCC-HPV的獨(dú)特基因組，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

2 HPV生物標(biāo)志物

目前HPV生物標(biāo)志物主要包括在組織中直接檢測(cè)病毒的DNA、P16和E6/E7 mRNA，在血清、血漿及唾液中檢測(cè)抗體、病毒的DNA和E6/E7 mRNA。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)新鮮腫瘤組織中HPVE6/E7 mRNA是診斷轉(zhuǎn)錄活躍的高危HPV的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其他檢測(cè)方法靈敏度和特異度的判斷也大多與該方法進(jìn)行比較。但由于新鮮腫瘤組織的獲取不適用于所有人群，且RT-PCR技術(shù)檢測(cè)病毒RNA本身也存在一定的局限性，在國(guó)內(nèi)外臨床中的應(yīng)用尚沒(méi)有普及。因此臨床上應(yīng)對(duì)不同檢測(cè)目的和樣本來(lái)源選擇適合的HPV生物標(biāo)志物進(jìn)行研究，以提高病毒的檢出率。

2.1 腫瘤組織中DNA水平

對(duì)HPV DNA的檢測(cè)可以直接反應(yīng)腫瘤組織中是否存在病毒。針對(duì)L1序列設(shè)計(jì)的引物(例如GP5/GP6 引物對(duì))能夠擴(kuò)增多種HPV類型，常被用于檢測(cè)多種HPV亞型。最新的一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中HPV DNA的靈敏度和特異度分別為98%和84%[13]。但還有一種情況是，病毒整合到宿主基因組后，L1區(qū)域可能被刪除，從而降低了HPV檢測(cè)的靈敏度。另外在石蠟包埋組織(FFPE)中，PCR技術(shù)也可能無(wú)法檢測(cè)到HPV，因?yàn)闃颖局械幕蚪M序列很可能在甲醛固定、儲(chǔ)存過(guò)程中被破壞了。同時(shí)由于PCR技術(shù)本身檢測(cè)的特點(diǎn)，結(jié)果的靈敏度較高，也可能會(huì)檢測(cè)到具有可疑致癌意義的極低拷貝數(shù)的病毒，從而增加了假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。

DNA原位雜交(ISH)技術(shù)是一種利用標(biāo)記DNA探針與HPV DNA序列互補(bǔ)技術(shù)對(duì)所有已知類型HPV進(jìn)行檢測(cè)的方法。高達(dá)10%的OPSCC-HPV是由HPV16以外的亞型引起的，因此雞尾酒探針對(duì)于多種高風(fēng)險(xiǎn)亞型的檢測(cè)有重要意義。該方法在高倍顯微鏡下不僅能夠直接觀測(cè)到是否有HPV DNA，還有助于確定HPV DNA在組織和細(xì)胞中的位置，進(jìn)而顯示病毒的狀態(tài)(擴(kuò)散信號(hào)表明存在游離型HPV，點(diǎn)狀信號(hào)表明存在整合型HPV)，從而提高了檢測(cè)的特異度。然而，由于缺乏清晰的染色信號(hào)，檢測(cè)人員主觀判斷所導(dǎo)致結(jié)果的差異可能高達(dá)10%?？偟膩?lái)說(shuō)，應(yīng)用PCR或ISH技術(shù)檢測(cè)組織或者細(xì)胞中的HPV DNA都不能確定HPV是否具有活性[5]。

2.2 腫瘤組織中RNA水平

相對(duì)于HPV DNA，HPVE6/E7 mRNA的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，RT-PCR針對(duì)不同HPV的E6/E7設(shè)計(jì)合適的引物，進(jìn)而分析病毒的亞型和評(píng)估病毒的毒性。然而，該技術(shù)操作難度較大，對(duì)結(jié)果的解釋也可能存在主觀判斷，故不適用于常規(guī)的病理實(shí)驗(yàn)室[13]。類似于DNA ISH，E6/E7 mRNA ISH也是采用雞尾酒探針的方法，從各種HPV亞型中對(duì)E6/E7 mRNA進(jìn)行檢測(cè)。目前常用的RNA-scope方法可以直接顯示常規(guī)處理組織中的病毒mRNA，并且能識(shí)別HPV在細(xì)胞中的位置，從而提高了檢測(cè)的特異度[14]。UKPO等[14]通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)腫瘤組織中的P16，結(jié)果與E6/E7 mRNA ISH的一致性達(dá)到了96.4%，與DNA ISH的一致性僅為79.3%，這也進(jìn)一步說(shuō)明E6/E7 mRNA ISH的靈敏度是優(yōu)于DNA ISH的。

無(wú)論哪種方法檢測(cè)RNA都要考慮到：①FFPE樣本中RNA可能受到污染或破壞。②生物體液樣本中含量較低的RNA可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

2.3 腫瘤組織中蛋白水平

P16是一種腫瘤抑制蛋白，通過(guò)抑制CDK4和CDK6的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而阻止PRb的磷酸化。在HPV的生命周期中，E7可使PRb失活，從而導(dǎo)致P16等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的上調(diào)且達(dá)到IHC容易檢測(cè)的水平，因此P16的上調(diào)可以作為活躍的HPV感染的標(biāo)志。由于低成本、易獲取、高靈敏度以及較高的觀察一致性，國(guó)外很多學(xué)者傾向于把P16作為OPSCC中HPV感染的替代標(biāo)志物。ABDELHAKAM等[15]針對(duì)104例OPSCC患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中P16陽(yáng)性率達(dá)到了89.4%。然而也有一些研究指出，P16的高表達(dá)并不能反映HPV的轉(zhuǎn)錄活性，因?yàn)槠渖哌€受到其他非致癌機(jī)制的調(diào)控，如與HPV無(wú)關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞以及良性鱗狀細(xì)胞也可以過(guò)度表達(dá)P16。TRIBIUS等[16]研究顯示采用IHC方法檢測(cè)腫瘤組織中P16大約有5%假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。P16作為HPV感染的替代指標(biāo)是否可靠在國(guó)內(nèi)外一直備受關(guān)注，但因我國(guó)HPV感染率較低，特異度較低的診斷標(biāo)志物作為獨(dú)立檢測(cè)指標(biāo)是不可靠的。故在不同地區(qū)需重新評(píng)估P16 IHC的診斷能力[5]。

2015年，CHI等[17]推薦以下方案來(lái)評(píng)估HPV的狀態(tài)：①對(duì)于完全或大部分非角質(zhì)化的腫瘤，P16高度且彌漫(即70%以上細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核)表達(dá)時(shí)，足以指示HPV陽(yáng)性，不需要再進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)；若P16陰性或者局部陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，則需要進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)；②對(duì)于角質(zhì)化腫瘤，P16高度且彌散表達(dá)時(shí)，需要進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)；若P16陰性或局部陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，足以指示HPV的陰性狀態(tài)，不需要HPV DNA檢測(cè)。

2020年我國(guó)《口腔癌及口咽癌病理診斷規(guī)范》中對(duì)于OPSCC患者提出了具體的推薦診斷方案。Ⅰ級(jí)推薦：所有病例均應(yīng)行P16 IHC檢測(cè)，當(dāng) P16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥70%、陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)且為中等至強(qiáng)陽(yáng)性，且組織學(xué)形態(tài)為非角化型鱗狀細(xì)胞癌時(shí)，應(yīng)報(bào)告“HPV相關(guān)性(P16+)鱗狀細(xì)胞癌”；Ⅱ級(jí)推薦：除行 P16 IHC檢測(cè)外，可行 HPV DNA或RNA檢測(cè)，對(duì)于HPV DNA或RNA檢測(cè)陽(yáng)性者，應(yīng)報(bào)告“OPSCC-HPV”。

2.4 體液中的生物標(biāo)記物

血清、血漿和唾液中生物標(biāo)記物在可獲得性、低侵入性、低成本性等方面具有優(yōu)勢(shì)，對(duì)其檢測(cè)有助于疾病早期和術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)。一種基于PCR的檢測(cè)唾液中HPVE6/E7 mRNA的方法，檢測(cè)結(jié)果與P16 IHC具有高度一致性。RETTIG等[18]收集了OPSCC-HPV患者治療前后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的唾液樣本，54%的患者在診斷時(shí)被檢測(cè)到HPV DNA，而經(jīng)治療后僅約5%患者唾液中可檢測(cè)到HPV DNA。重要的是，所有治療后復(fù)發(fā)OPSCC-HPV患者均與HPV持續(xù)感染相關(guān)[18]。

研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7血清抗體與OPSCC風(fēng)險(xiǎn)之間具有顯著相關(guān)性。KREIMER 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，有34.8% OPSCC患者血清中被檢測(cè)到HPV E6抗體，而在健康對(duì)照組中僅占0.7%，值得關(guān)注的是部分診斷為OPSCC患者在10年前血清中就已檢測(cè)出存在HPV E6抗體。這可能意味著血清中HPV16 E6抗體陽(yáng)性人群患OPSCC風(fēng)險(xiǎn)較高。

AHN等[20]應(yīng)用PCR方法檢測(cè)了81例OPSCC-HPV患者的血漿，約有67%的樣本在治療前就檢測(cè)到了HPV DNA。CHERA等[21]利用相同技術(shù)對(duì)115例患者的1 006份血漿樣本進(jìn)行了檢測(cè)，87例患者在治療后監(jiān)測(cè)期間內(nèi)未檢測(cè)到HPV DNA，并且均未出現(xiàn)復(fù)發(fā)；28例患者在治療后監(jiān)測(cè)期間檢測(cè)到HPV DNA，其中15例患者經(jīng)活檢證實(shí)復(fù)發(fā)；16例患者連續(xù)2次HPV DNA血漿檢測(cè)陽(yáng)性，其中15例經(jīng)活檢證實(shí)復(fù)發(fā)。這些數(shù)據(jù)對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和開展進(jìn)一步治療非常有幫助。

3 結(jié)語(yǔ)

生物標(biāo)志物是指可以提示系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生改變的生化指標(biāo)，具有非常廣泛的用途。檢測(cè)一種疾病特異性的生物標(biāo)志物，對(duì)于疾病的鑒定、早期診斷、預(yù)防和治療有著至關(guān)重要的作用。因?yàn)榫哂谐杀靖?、樣本更易獲取和大眾更易接受的特點(diǎn)。針對(duì)唾液、血漿中HPV DNA和血清中HPV抗體的檢測(cè)，比較適用于臨床大規(guī)模的篩查和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)，然而其檢測(cè)結(jié)果靈敏度偏低，這可能與液態(tài)樣本中病毒含量較低或者檢測(cè)技術(shù)不成熟等有關(guān)。目前針對(duì)組織樣本的檢測(cè)主要有PCR、ISH和IHC等技術(shù)。檢測(cè)方法各有利弊，也沒(méi)有足夠的證據(jù)證明僅采用一種檢測(cè)方法就可以確診。這里需要注意的是，要將一種檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床實(shí)踐，需要的不是靈敏度高到可以檢測(cè)到少量HPV(可能來(lái)自無(wú)關(guān)的感染或污染)，而是要證明病毒的轉(zhuǎn)錄活性是否已經(jīng)可以導(dǎo)致癌癥，同時(shí)要結(jié)合 OPSCC-HPV 臨床表現(xiàn)。因此，當(dāng)前較多學(xué)者提出了多模態(tài)檢測(cè)，其原理是利用單個(gè)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)來(lái)優(yōu)化HPV檢測(cè)結(jié)果整體可靠性。

總而言之，未來(lái)OPSCC-HPV的檢測(cè)應(yīng)該滿足非侵入性、低成本及易操作的特點(diǎn)，從而做到早診斷、早治療，以提高患者的總體生存率。