選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑對高糖血癥大鼠胰腺組織氧化損傷等的影響

張昊旻 喬炳龍 李超 齊衛(wèi)紅 盧彩霞 孫平

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東 青島 266003； 2 諸城市婦幼保健院產(chǎn)科；3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院放射科； 4 青島市第三人民醫(yī)院產(chǎn)科)

妊娠期糖尿病(GDM)為妊娠期常見的代謝紊亂性疾病，嚴(yán)重威脅孕婦及胎兒身體健康[1]。GDM患者不僅子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)增加，而且在以后的生活中患2型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增高[2-4]，其后代在青春期和成年早期更容易發(fā)生糖耐量受損及心血管系統(tǒng)疾病[5]。全世界GDM發(fā)病率呈逐年上升趨勢，受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。國際糖尿病聯(lián)合協(xié)會(huì)(IDF)2019年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球范圍內(nèi)約1/6新生兒受到孕期高糖血癥的影響[6]。然而，由于妊娠期的特殊性，孕婦除了控制飲食和適量運(yùn)動(dòng)的生活方式干預(yù)，以及偶爾的胰島素治療之外，GDM沒有更為有效的治療和預(yù)防策略[7-8]。

GDM臨床過程復(fù)雜，其具體發(fā)病機(jī)制至今尚未十分明確。研究表明，多種因素可引起GDM的發(fā)生，如胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能缺陷及妊娠期激素分泌異常等[9]。雌激素是女性體內(nèi)最重要的類固醇激素之一，在調(diào)節(jié)機(jī)體代謝中發(fā)揮著重要作用，其中雌二醇(E2)是妊娠期胎盤合成和分泌的主要激素之一，在女性血糖代謝中具有重要功能[10]。雌激素需要與ER結(jié)合后激活經(jīng)典的信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)揮多種雌激素效應(yīng)。ER包括ERα和ERβ兩種亞型，其中ERα參與介導(dǎo)多數(shù)雌激素效應(yīng)，特別是雌激素對血糖代謝的調(diào)節(jié)[11]，ERα基因的異常表達(dá)可能參與GDM的發(fā)生發(fā)展[12]。此外，ERα基因敲除的小鼠可有葡萄糖耐量的改變，表明ERα在胰島素調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[13]，但具體的作用機(jī)制尚不明確。糖類代謝紊亂造成血糖濃度長期偏高，引起高糖血癥，持續(xù)或波動(dòng)性高糖環(huán)境導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量活性氧，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞死亡[14]。鐵死亡是近年新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，常伴隨細(xì)胞鐵含量和活性氧的積累，被證明與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而鐵死亡在高糖血癥發(fā)生過程中的作用尚不明確。本研究旨在通過構(gòu)建鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的高糖血癥大鼠模型，探討選擇性ER調(diào)節(jié)劑對高糖血癥大鼠胰腺組織氧化損傷等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雌性SD大鼠24只，雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量180～220 g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。在室溫23～25 ℃、相對濕度65%～70%、12-12 h循環(huán)光照環(huán)境中飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)，并通過我院委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑及設(shè)備 過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，STZ(美國Sigma公司)，ELISA試劑盒(武漢依萊瑞特生物科技股份有限公司)，兔抗-長鏈脂酰CoA合成酶4(ACSL4)、ERα、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)抗體均購買自中國Abclonal公司，兔抗-鐵蛋白重鏈1(FTH1)抗體購買自美國Affinity公司，兔抗-GAPDH抗體(杭州賢至生物科技有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)，ABI PRISM 7900 PCR儀(Applied美國Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及干預(yù) 大鼠經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照雌雄2∶1比例合籠過夜，次日清晨將其分開，雌性大鼠陰道分泌物中鏡檢觀測到精子者確定為孕鼠，記做妊娠D0。隨機(jī)選取6只孕鼠為正常對照組(A組)，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。對剩余孕鼠腹腔注射STZ溶液(45 mg/kg)，24 h后空腹尾部采血檢測血糖濃度，以血糖濃度>11.1 mmol/L為高糖血癥大鼠模型制備成功。取18只模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為高糖血癥模型組(B組)、他莫昔芬(TAM)低劑量組(C組)及TAM高劑量組(D組)，每組6只。B組大鼠不做任何處理，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，C、D組大鼠每天分別腹腔注射2.5、5.0 mg/kg的TAM進(jìn)行藥物干預(yù)處理，14 d后斷頸處死所有大鼠，取大鼠胰腺組織樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(RT-qPCR)檢測胰腺組織中ERα等基因表達(dá)水平 將胰腺組織于液氮中研磨后，Trizol法提取總RNA，測定RNA的濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR?Green Real-time PCR-Msater Mix(Toyobo，日本)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以GADPH作為內(nèi)參照，引物名稱及其序列見表1。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算胰腺組織中ERα、ACSL4、GPX4及FTH1 mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

表1 引物名稱及其序列

1.2.3Western Blot方法檢測胰腺組織中ERα、ACSL4、GPX4和FTH1蛋白的表達(dá)水平 將胰腺組織置于含有蛋白酶抑制劑PMSF的裂解緩沖液中裂解，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，使用BCA蛋白試劑盒檢測上清液中的蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，使用120 g/L的SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于50 g/L脫脂乳中常溫封閉2 h，加入特異性一抗4 ℃孵育過夜。一抗分別為兔抗-ERα抗體(1∶1 000)、兔抗-ACSL4抗體(1∶1 000)、兔抗-GPX4抗體(1∶1 000)、兔抗-FTH1抗體(1∶1 000)及兔抗-GAPDH抗體(1∶1 000)。洗脫游離一抗后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗在常溫下孵育2 h，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光顯影后，通過Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.4大鼠胰腺組織生化分析 采用組織生化分析試劑盒檢測大鼠胰腺組織中過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量以及SOD、CAT、GSH-PX的活性水平；采用比色法檢測胰腺組織中的鐵含量。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5蘇木精-伊紅染色觀察大鼠胰腺組織形態(tài)將胰腺組織采用體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水至透明，包埋于石蠟中并切成大小約1 cm3的小塊，行5 μm厚切片，60 ℃烤片后，用蘇木精和伊紅染色，在生物光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織形態(tài)。

1.2.6透射電子顯微鏡觀察胰島細(xì)胞形態(tài) 將浸泡在體積分?jǐn)?shù)為0.025的戊二醛固定液(4 ℃，pH為7.8)中的胰島組織樣本，4 ℃下用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)充分清洗3次，每次15 min；然后用0.1 mol/L鋨酸室溫(20 ℃)固定2 h，4 ℃下用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)再度清洗3次；接著用體積分?jǐn)?shù)為0.3～1.0的乙醇梯度脫水，丙酮置換后，環(huán)氧樹脂浸透包埋。包埋塊行30 nm厚超薄切片，并載于200目銅網(wǎng)上，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛電子染色，采用FEI Tecnai G20 TWIN 型透射電鏡(TEM)觀察并拍照，加速電壓為80 kV。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰腺組織中ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

RT-qPCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示，A～D組大鼠胰腺組織中ERα mRNA的表達(dá)水平分別為1.01±0.17、3.67±0.31、2.71±0.36、1.93±0.30，ERα蛋白表達(dá)水平分別為0.05±0.01、0.31±0.07、0.16±0.05、0.07±0.02，4組大鼠胰腺組織ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異具有顯著性(F=44.86、23.29，P<0.05)，其中B組大鼠胰腺組織中ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平與A組比較顯著升高(t=13.14、6.81，P<0.05)；C、D組的ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平與B組比較顯著降低(t=3.18～7.10，P<0.05)。

2.2 各組大鼠胰腺組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平及鐵含量比較

生化檢測結(jié)果顯示，4組大鼠胰腺組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平及鐵含量比較差異具有顯著性(F=50.82～204.01，P<0.05)，其中B組大鼠胰腺組織中CAT、SOD、GSH-PX等的活性以及GSH含量與A組比較顯著降低(t=11.83～14.45，P<0.05)，而H2O2、MDA及鐵含量與A組比較顯著升高(t=12.50～15.77，P<0.05)；C、D組CAT、SOD、GSH-PX等的活性以及GSH含量與B組比較顯著升高(t=4.36～20.29，P<0.05)，而H2O2、MDA水平以及鐵含量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.22～11.62，P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胰腺組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平及鐵含量比較

2.3 大鼠胰腺組織中鐵死亡通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平比較

RT-qPCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示，4組大鼠胰腺組織中鐵死亡通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平比較差異具有顯著意義(F=31.06～84.37，P<0.05)，其中B組大鼠胰腺組織中GPX4、FTH1 mRNA以及蛋白表達(dá)水平與A組比較顯著降低，而ACSL4 mRNA和蛋白表達(dá)水平與A組比較顯著升高(t=7.30～13.55,P<0.05)；C、D組與B組比較，GPX4、FTH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，而ACSL4 mRNA和蛋白表達(dá)水平則顯著降低(t=2.13～8.58，P<0.05)。見表3。

表3 鐵死亡通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平比較

2.4 大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)變化情況

胰腺組織HE染色結(jié)果顯示，與A組相比，B組大鼠的胰島形態(tài)不規(guī)則，胰島與外分泌腺界限模糊，胰島細(xì)胞胞漿數(shù)量減少，部分胰島細(xì)胞胞漿空泡變性；而C、D組大鼠與B組相比，胰島形態(tài)趨于規(guī)則，少見胞漿空泡的胰島細(xì)胞，胰島與外分泌腺界限清晰，胰島細(xì)胞胞漿數(shù)量與對照組沒有明顯差異，D組大鼠胰島損傷的程度明顯輕于C組(圖1)。

2.5 大鼠胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

透射電鏡觀察胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，A組大鼠胰島細(xì)胞胞漿內(nèi)分布著大量電子致密的分泌顆粒，呈圓形，大小200～500 nm，外包界膜，界膜與芯之間的間隙較大，芯有不同程度的電子密度，細(xì)胞核大呈圓形，染色質(zhì)均勻分布，線粒體可見明顯的嵴結(jié)構(gòu)(圖2A)；B組大鼠胰島細(xì)胞受損變形，胞漿中分泌顆粒數(shù)量及電子沉積密度明顯下降，部分分泌顆粒界膜消失，線粒體腫脹變形，嵴結(jié)構(gòu)消失呈空泡化(圖2B)；C、D組大鼠胰島細(xì)胞胞漿中分泌顆粒數(shù)量相對于B組大鼠明顯增加，線粒體可見明顯嵴結(jié)構(gòu)(圖2C、D)。

上排放大倍數(shù)100倍，右下角bar代表50 μm；下排為上排黑色框區(qū)域的局部放大(200倍)，右下角bar值代表100 μm；黑色箭頭所指為胰島

A～D分別代表A～D組，圖中n為細(xì)胞核，mt為線粒體，sg為分泌顆粒

3 討 論

GDM嚴(yán)重危害母嬰健康，全球范圍內(nèi)約1/6新生兒受到孕期高血糖的影響[6]，其臨床過程復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)胎盤組織中ERα基因表達(dá)水平與GDM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[12]，然而其具體機(jī)制未知。研究證實(shí)，ERα可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的表達(dá)，ERα的異常表達(dá)會(huì)影響GLUT4的表達(dá)及功能，這可能影響胰島素的信號傳導(dǎo)和葡萄糖攝取，導(dǎo)致妊娠期胰島素抵抗，進(jìn)而發(fā)展為GDM[15]。

本研究通過對STZ誘導(dǎo)的高糖血癥大鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，B組大鼠胰腺組織中ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平與A組相比顯著升高。選擇性ER調(diào)節(jié)劑TAM腹腔注射高糖血癥大鼠，能夠明顯降低ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平。TAM作為選擇性ER調(diào)節(jié)劑，能夠有效地阻斷雌激素與ER的結(jié)合，使得雌激素不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。大量證據(jù)表明，機(jī)體內(nèi)雌激素水平的變化同時(shí)也伴隨著鐵儲(chǔ)量的變化[16-17]。過度的鐵負(fù)荷會(huì)影響機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，與高血糖之間存在密切聯(lián)系[18-20]。本研究中，B組大鼠胰腺組織中鐵含量明顯高于A組，但是在ERα表達(dá)抑制的C、D組中，鐵含量明顯低于B組。對細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)分析顯示，B組大鼠的胰腺組織中CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性以及GSH含量顯著低于A組，而H2O2、MDA水平顯著高于A組。這種抗氧化劑的減少和氧化應(yīng)激產(chǎn)物的增加會(huì)導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生，從而直接損害β細(xì)胞[21]。對胰腺組織的HE染色結(jié)果顯示，B組大鼠胰腺組織出現(xiàn)明顯的病理損傷，這可能是ROS的過量積累導(dǎo)致的。隨著ERα水平降低，大鼠胰腺組織中抗氧化酶活性以及GSH含量明顯升高，H2O2、MDA的水平明顯降低，且高糖血癥引起的胰腺組織病理損傷也得到明顯緩解。以上這些結(jié)果表明，ERα表達(dá)水平的下降，降低了組織鐵水平及氧化應(yīng)激損傷，緩解了高糖血癥引起的胰腺組織病理損傷。

鐵離子的大量積累和脂質(zhì)過氧化的爆發(fā)，提示細(xì)胞鐵死亡。鐵死亡是近年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為線粒體皺縮，線粒體嵴減少或消失。鐵死亡被證實(shí)與多種疾病相關(guān)，已有研究表明，可以通過激活或抑制鐵死亡來干預(yù)疾病的發(fā)展[22-23]。本研究通過透射電子顯微鏡觀察胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，B組大鼠胰島細(xì)胞中呈現(xiàn)明顯的鐵死亡特征，線粒體相比于A組明顯皺縮，線粒體嵴消失。鐵死亡通路中關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，B組大鼠胰腺組織中GPX4、FTH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平相對于A組顯著降低，而ACSL4 mRNA和蛋白表達(dá)水平相對于A組顯著升高。GPX4活性被抑制，導(dǎo)致膜脂上活性氧自由基的積累，而FTH1的活性被抑制導(dǎo)致鐵離子儲(chǔ)存調(diào)控被破壞，使得細(xì)胞內(nèi)的鐵含量升高[24-25]，ACSL4的活性升高，使得易被氧化的膜磷脂的合成增加，引發(fā)鐵死亡。而通過抑制ERα的表達(dá)水平，C、D組大鼠胰島細(xì)胞內(nèi)可見正常線粒體，出現(xiàn)完整的線粒體嵴。同時(shí)基因GPX4和FTH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平相對于B組大鼠明顯升高，而ACSL4 mRNA和蛋白表達(dá)水平相對于B組大鼠明顯降低，呈現(xiàn)出鐵死亡抑制狀態(tài)。這些結(jié)果表明，高糖血癥大鼠出現(xiàn)明顯鐵死亡，而ERα mRNA和蛋白表達(dá)水平的抑制可以顯著降低細(xì)胞鐵死亡，推測ERα的表達(dá)水平影響雌激素的作用進(jìn)而影響機(jī)體鐵水平和氧化應(yīng)激水平。

總之，本研究結(jié)果顯示，選擇性ER調(diào)節(jié)劑可能通過ER介導(dǎo)抑制胰腺組織氧化應(yīng)激水平，降低細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而緩解高糖血癥所致大鼠胰腺的病理損傷。后期還需要更多的臨床試驗(yàn)和體外研究來分析ERα水平在高糖血癥病程中所發(fā)揮的作用，并對其作為潛在藥物靶點(diǎn)用以治療妊娠期高糖血癥的可行性進(jìn)行分析。