熒光探針在自噬檢測中的應(yīng)用

袁媛 徐翠萍 張吉甜

(山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000 1 臨床營養(yǎng)科； 2 肺功能室)

自噬(autophagy)是細(xì)胞中一種進(jìn)化保守的生命現(xiàn)象,其主要作用是清除和降解自身受損的細(xì)胞器以及多余的生物大分子,并利用降解產(chǎn)物提供能量和重建細(xì)胞結(jié)構(gòu),對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生命活動(dòng)有重要意義[1]。自噬根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的途徑不同一般分為3類：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬發(fā)生時(shí)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體周圍形成一個(gè)小的類似“脂質(zhì)體”樣的雙層膜碗口狀結(jié)構(gòu)，被稱為phagophore。當(dāng)phagophore不斷延伸，將胞漿中衰老的細(xì)胞器、折疊錯(cuò)誤的蛋白等全部攬入“碗”中，然后“收口”，從而成為密閉球狀的autophagosome，即“自噬體”。然后，自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，即自噬溶酶體，期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解，自噬體中的“貨物”也被降解，產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中，供細(xì)胞重新利用，而殘?jiān)虮慌懦黾?xì)胞外或滯留在胞漿中[2]。自噬參與調(diào)節(jié)許多生理過程，包括營養(yǎng)素剝奪、圍著床期胚胎發(fā)育、能量缺失、氧化應(yīng)激等，并參與多種疾病如糖尿病、糖尿病腎病、阿爾茨海默癥、骨性關(guān)節(jié)炎及多種腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3-5]。

自噬的靜態(tài)檢測方法眾多，包括利用電子透射顯微鏡直接觀察不同階段的自噬結(jié)構(gòu)，或基于免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，缺點(diǎn)是自噬具有多態(tài)、多步驟、動(dòng)態(tài)的特點(diǎn)，某一時(shí)間點(diǎn)的自噬檢測不足以客觀反映自噬活性。現(xiàn)階段通常以自噬通量作為自噬水平的度量標(biāo)準(zhǔn)，包括底物從被自噬體包裹到運(yùn)至溶酶體降解的全過程。自噬通量的檢測中，熒光探針具備可視化、可定量、染色簡便、細(xì)胞毒性低、設(shè)計(jì)靈活等特點(diǎn)，應(yīng)用極為廣泛[6]。在此，本文總結(jié)了當(dāng)前常用及新型探針的設(shè)計(jì)原理、優(yōu)點(diǎn)及不足、應(yīng)用范圍等，以便在自噬研究中合理應(yīng)用。

1 微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)標(biāo)記熒光探針檢測自噬通量

LC3是自噬檢測的一個(gè)熱門靶點(diǎn)，其泛素化樣結(jié)合于自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)，是定位于自噬體的獨(dú)特修飾物。LC3由proLC3合成，proLC3的羧基末端被半胱氨酸蛋白酶切割，以暴露其羧基末端甘氨酸殘基Gly，形成LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ經(jīng)過剪切和泛素化修飾過程，與自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的磷脂酰乙醇胺和(或)磷脂酰絲氨酸(PE)結(jié)合形成LC3-磷脂綴合物(LC3-Ⅱ)，定位于自噬體[7-9]。隨著自噬體與溶酶體融合，自噬體胞質(zhì)面上的LC3-Ⅱ被Atg4B脫脂形成LC3-Ⅰ，進(jìn)入再循環(huán)，而自噬體腔表面上的LC3-Ⅱ被溶酶體水解酶降解。因此，LC3是一種很有前景的自噬體標(biāo)記物，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換及LC3-Ⅱ的降解，可區(qū)分自噬體數(shù)量和降解活性，并確定自噬過程是否已到達(dá)降解步驟[10]。

1.1 單熒光標(biāo)記蛋白(FP)-LC3s

一般情況下，F(xiàn)P-LC3s，例如GFP-LC3、EGFP-LC3、YFP-LC3、CFP-LC3、RFP-LC3、mCherry-LC3和HcRed-LC3等，彌散分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，自噬被誘導(dǎo)時(shí)，F(xiàn)P-LC3被脂化并定位于自噬體和自噬溶酶體，形成熒光斑點(diǎn)，但利用熒光顯微鏡技術(shù)計(jì)量熒光斑點(diǎn)和強(qiáng)度并不能反映自噬通量的大小。因?yàn)榘唿c(diǎn)的聚集既可能是自噬被誘導(dǎo)，也可能是下游通路如自噬體和溶酶體融合障礙，或者是溶酶體內(nèi)酶降解缺陷所致。因此，F(xiàn)P-LC3s在應(yīng)用時(shí)一般需要加溶酶體抑制劑作為對照，溶酶體降解的抑制可以導(dǎo)致FP-LC3斑點(diǎn)進(jìn)一步增加，表示自噬通量增加。此外，C端甘氨酸突變的LC3ΔG，因?yàn)椴荒鼙籄tg4切割，不能轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，也可作為陰性對照。

利用熒光顯微鏡通過觀察FP-LC3檢測自噬的局限性主要為，生理性自噬時(shí)FP-LC3也會(huì)形成少量的熒光斑點(diǎn)，難以和誘導(dǎo)性自噬相區(qū)分；另外，在FP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過程中若過表達(dá)，自身容易發(fā)生聚集，使自噬通量被高估。此時(shí)，可以設(shè)立C端甘氨酸突變的FP-LC3ΔG對照，因其不能被Atg4切割，不能轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，可作為陰性對照組。另外，自噬誘導(dǎo)劑如巴非霉素A1、氯喹或蛋白酶抑制劑可能引起附加效應(yīng)，比如中和或抑制溶酶體酶可抑制mTOR，誘導(dǎo)自噬[11-12]；氯喹可以促進(jìn)除自噬誘導(dǎo)外的LC3-Ⅱ形成[13]，并且氯喹、秋水仙堿和亮蛋白等溶酶體抑制劑對不同組織(器官)的作用似乎不同，精確檢測LC3-Ⅱ需要合理選擇溶酶體抑制劑作為對照[14]。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測FP-LC3熒光蛋白的強(qiáng)度分析自噬通量時(shí)，一般應(yīng)用皂素使細(xì)胞破膜，使水溶性LC3-Ⅰ洗脫，定位于自噬體膜的脂溶性LC3-Ⅱ則仍保留在細(xì)胞內(nèi)。此時(shí)聯(lián)用自噬抑制劑并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，即可區(qū)分FP-LC3-Ⅱ熒光強(qiáng)度的增加是自噬通量增強(qiáng)還是自噬下游抑制所致。

另外，還可以應(yīng)用Western-blot實(shí)驗(yàn)對熒光蛋白抗體進(jìn)行檢測。如GFP-LC3-Ⅱ進(jìn)入溶酶體以后，LC3-Ⅱ會(huì)被酶解，GFP則被保留。應(yīng)用GFP抗體可以檢測到GFP-LC3-Ⅰ、GFP-LC3-Ⅱ及GFP 3條免疫印跡。其中，游離GFP條帶表示自噬通量活化。同時(shí)，也應(yīng)當(dāng)使用自噬抑制劑作為對照，可避免GFP被自噬過度活化水解出現(xiàn)假陰性。

1.2 雙熒光串聯(lián)探針(Tf)-LC3

在FP-LC3應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，EGFP-LC3發(fā)出的綠色熒光在溶酶體酸性條件下發(fā)生熒光衰減或猝滅，mRFP-LC3發(fā)射的紅色熒光在自噬溶酶體酸性環(huán)境中相對穩(wěn)定。這種差異是由EGFP-LC3和mRFP-LC3的解離常數(shù)pKa(EGFP的pKa 5.9，mRFP的pKa 4.5)決定的[15]。pKa越高，在溶酶體等酸性囊泡中越容易發(fā)生熒光猝滅。由此，一種新型單分子雙熒光串聯(lián)蛋白標(biāo)記的mRFP-EGFP-LC3探針開始用于監(jiān)測自噬體成熟過程[15]。mCherry-EGFP-LC3、mKate2-EGFP-LC3熒光探針均屬于此類Tf-LC3探針[16]。一般情況下，Tf-LC3的綠色和紅色雙陽性熒光呈黃色彌散分布在細(xì)胞質(zhì)(pH 7.4)中，自噬誘導(dǎo)時(shí)，Tf-LC3分別定位于自噬體和自噬溶酶體(pH 4～5)，呈現(xiàn)黃色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)。自噬誘導(dǎo)時(shí)，黃色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)數(shù)目均增加，當(dāng)自噬體與溶酶體融合被抑制時(shí)，導(dǎo)致黃色熒光斑點(diǎn)增加，紅色熒光斑點(diǎn)降低。因此，可以通過計(jì)算紅色和黃色熒光斑點(diǎn)的比例判斷自噬通量的強(qiáng)弱。

在自噬研究中，Tf-LC3探針主要用來示蹤自噬體的成熟過程，可以通過激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和活細(xì)胞工作站進(jìn)行檢測。

當(dāng)使用Tf-LC3探針檢測自噬時(shí)，綠色熒光蛋白有較高的pH敏感性，在溶酶體內(nèi)完全猝滅，是靈敏區(qū)分自噬體和自噬溶酶體、監(jiān)測自噬體成熟步驟的關(guān)鍵[17]?；诖嗽恚琾Hlurorin-mKate2-LC3以及mTagRFP-mWasabi-LC3探針應(yīng)運(yùn)而生，其中pHlurorin(pKa 7.6)pH敏感度高于mWasabi(pKa 6.5)和EGFP(pKa 5.9)[17-19]，在溶酶體內(nèi)猝滅更完全，檢測自噬的靈敏度更高。

Tf-LC3探針的局限性體現(xiàn)在，當(dāng)其轉(zhuǎn)移至溶酶體時(shí)，雖然RFP比GFP更穩(wěn)定，但是最終仍然會(huì)被降解[20]。故選擇pH更加穩(wěn)定的紅色熒光蛋白，如mKate2、mCherry可以相對提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，與RFP串聯(lián)，GFP信號(hào)強(qiáng)度會(huì)因熒光再吸收或熒光共振能量轉(zhuǎn)移而降低，同時(shí)自噬誘導(dǎo)改變了RFP隨LC3在細(xì)胞內(nèi)的分布，也會(huì)影響用熒光顯微鏡進(jìn)行比率分析的精確度。因此，Tf-LC3探針更適宜于檢測個(gè)體自噬結(jié)構(gòu)的成熟過程。進(jìn)一步聯(lián)合紅外標(biāo)記的溶酶體探針則可以進(jìn)一步研究自噬小體、自噬溶酶體、溶酶體三者的動(dòng)態(tài)變化。

1.3 雙熒光內(nèi)對照探針GFP-LC3-RFP-LC3ΔG

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG雙熒光內(nèi)對照探針可以將GFP-LC3融合到缺失C末端甘氨酸的RFP-LC3ΔG的N末端，可用于定量評(píng)估自噬通量。在胞質(zhì)中，ATG4B在LC3的C末端甘氨酸后切割肽鍵[8]，將GFP-LC3-RFP-LC3ΔG分離為等摩爾量的GFP-LC3和RFP-LC3ΔG。GFP-LC3與PE綴合并定位于自噬體。與溶酶體融合后，自噬體內(nèi)膜上的GFP-LC3被降解，外膜上的GFP-LC3被ATG4蛋白解耦聯(lián)并再循環(huán)回到胞質(zhì)溶膠當(dāng)中。RFP-LC3ΔG因C末端甘氨酸缺乏不能進(jìn)行脂質(zhì)化，故不參與自噬過程，穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，作為內(nèi)部對照。自噬通量的高低由GFP/RFP熒光信號(hào)比表示。GFP/RFP比值高，自噬活性弱；比值低，自噬活性強(qiáng)。

筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，GFP-LC3-RFP-LC3ΔG在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、小鼠胰島β細(xì)胞(min6)、大鼠胰島素細(xì)胞(INS-1)、小鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞(β-TC3)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中均可穩(wěn)定表達(dá)。作為單分子探針，在細(xì)胞質(zhì)被切割成等摩爾量的GFP-LC3(自噬底物)和RFP-LC3ΔG(內(nèi)部對照)，與Tf-LC3探針相比不改變RFP在細(xì)胞內(nèi)的分布，避免了RFP在溶酶體酸性壞境下的微弱降解，精確度更高。此外，以RFP-LC3ΔG作為內(nèi)部對照，相對于單熒光FP-LC3s，除不需要額外設(shè)立溶酶體抑制劑對照組外，還可以確定GFP強(qiáng)度的降低是因自噬增強(qiáng)，還是因LC3合成和(或)細(xì)胞數(shù)量的減少所致。因此，此探針非常適用于藥物高通量篩選，因?yàn)樗幬锉旧矶拘跃蜁?huì)造成細(xì)胞的活力降低以及自身LC3合成減少而導(dǎo)致GFP熒光強(qiáng)度的降低。KAIZUKA等[21]應(yīng)用此探針重新檢測了1 054種藥物，鑒定出13種新型誘導(dǎo)劑和18種新型抑制劑，并且此探針確定的43種抑制劑中有6種之前被定義為自噬誘導(dǎo)劑。另外，此探針不但可以進(jìn)行體外細(xì)胞的自噬監(jiān)測，還可以對活體生物體內(nèi)基礎(chǔ)自噬進(jìn)行監(jiān)測，如監(jiān)測斑馬魚受精卵著床期自噬活性；通過構(gòu)建表達(dá)GFP-LC3-RFP-LC3ΔG的轉(zhuǎn)基因小鼠，可以用來監(jiān)測生理狀態(tài)下不同器官以及組織的基礎(chǔ)自噬水平[22]。在此基礎(chǔ)上，2020年YAZAWA等[22]構(gòu)建了更敏感的pHluorin-LC3-mCherry內(nèi)對照探針，并且結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于小鼠全基因組gRNA篩選。綜上所述，新型內(nèi)對照熒光探針GFP-LC3-RFP-LC3ΔG可應(yīng)用免疫熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、活細(xì)胞工作站等技術(shù)檢測自噬水平，適用于高通量篩選和測量體內(nèi)基礎(chǔ)、病理狀態(tài)及藥物干預(yù)后的自噬水平。

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG探針整合到慢病毒基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，LC3和LC3ΔG容易發(fā)生同源重組，需通過克隆篩選避免無法降解的GFP-LC3ΔG出現(xiàn)[21]。所以單純定量監(jiān)測自噬通量，可用GFP-LC3-RFP作為替代，不影響結(jié)果準(zhǔn)確性，但無法示蹤細(xì)胞質(zhì)LC3的翻譯后修飾過程[23-24]。此外，相比GFP-LC3在饑餓誘導(dǎo)自噬時(shí)30 min就能形成熒光斑點(diǎn)，此探針2～4 h才能觀察到明顯的GFP/RFP比率降低，時(shí)效性不足。另外，動(dòng)物體內(nèi)各種細(xì)胞、組織探針表達(dá)水平存在差異，導(dǎo)致比率變化可能會(huì)不一致。

2 溶酶體途徑相關(guān)熒光標(biāo)記蛋白

2.1 雙激發(fā)峰熒光染料Keima

Keima是一種pH敏感、雙激發(fā)比率熒光蛋白，具有溶酶體蛋白酶的抗性。Keima在波長620 nm處具有發(fā)射峰，同時(shí)具有pH值依賴的雙激發(fā)峰。在細(xì)胞質(zhì)中性pH條件下，Keima在波長440 nm位置具有激發(fā)峰，并且在溶酶體酸性區(qū)室中其激發(fā)峰移至波長550 nm位置。因此，可以通過在波長550 nm/440 nm處激發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比率計(jì)算隨時(shí)間從胞漿遞送至溶酶體的Keima的量。Keima應(yīng)用時(shí)常與目標(biāo)蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器靶向肽融合，以監(jiān)測特定蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器的定位，多是用于評(píng)估選擇性自噬[25]。比如，將Keima融合到細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ序列當(dāng)中后可構(gòu)建線粒體靶向Keima的mt-mKeima[26-27]；把Keima定位在核糖體上，可研究核糖體自噬情況[28]。

微自噬可以直接將Keima從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體并導(dǎo)致波長550 nm/440 nm處激發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比率增加[25]，而不經(jīng)過自噬體形成階段。因此，要精確測量Keima的波長550 nm/440 nm處激發(fā)的信號(hào)強(qiáng)度比率的變化是否完全為自噬體-自噬溶酶體的途徑自噬，應(yīng)當(dāng)同時(shí)測定Keima和巨自噬標(biāo)記蛋白，如LC3/p62。此外，Keima具有溶酶體酸性依賴性，因此不能用來測評(píng)固定后的細(xì)胞和組織。

2.2 酸性依賴熒光染料LysoTracker與DQ-BSA

LysoTracker在酸性環(huán)境下發(fā)出熒光[29]，可示蹤活細(xì)胞溶酶體。DQ-BSA是熒光蛋白酶底物衍生的牛血清白蛋白，被溶酶體、自噬溶酶體等酸性區(qū)室內(nèi)的蛋白酶消化后釋放熒光[30]，可示蹤溶酶體和檢測溶酶體功能是否正常。AHSAN等[31]應(yīng)用此探針驗(yàn)證了番茄紅素可通過改善溶酶體功能促進(jìn)自噬，從而發(fā)揮對缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。兩者通常聯(lián)合LC3巨自噬標(biāo)記物或其他選擇性自噬探針，通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測自噬通量。

2.3 線粒體特異性雙激發(fā)/發(fā)射波長(ex/em)熒光染料HQO

線粒體自噬通常使用定位于線粒體和自噬體/溶酶體的熒光共定位方法評(píng)估。HQO是一種常用于評(píng)估線粒體自噬的花青色染料，毒性小，具有pH依賴的雙(ex/em)波長，其可以特異性地積聚在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)。在線粒體內(nèi)，pH為中性情況下，ex/em波長為530 nm/650 nm時(shí)，呈綠色。當(dāng)線粒體呈遞到溶酶體后，HQO被質(zhì)子化為HQOH+，并且其ex/em波長移至710 nm/750 nm時(shí)，呈紅色。因此，HQOH+/HQO熒光發(fā)射比率可用于測定線粒體自噬通量的大小。而激光共聚焦顯微鏡可以通過熒光顏色變化示蹤線粒體自噬的過程。HQO可以選擇性聚集在線粒體內(nèi)，且質(zhì)子化前后斯托克位移大于100 nm，無需與其他探針分子聯(lián)用即可特異性地檢測線粒體自噬通量。但HQO和Keima一樣均具有pH依賴性，不可以用來測定固定后的細(xì)胞和組織。

2.4 陽離子雙親熒光染料Cyto-ID

Cyto-ID是一種陽離子雙親熒光示蹤染料，與LysoTracker或DQ-BSA相比，Cyto-ID可特異性標(biāo)記自噬囊泡，而不對酸性溶酶體或自噬溶酶體區(qū)室染色，可以靈敏地區(qū)分巨自噬和微自噬，其與溶酶體抑制劑如BAF和CQ聯(lián)合使用，可以評(píng)估自噬通量[32]。Cyto-ID適用于熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀和分光光度計(jì)檢測技術(shù)，多用于RNAi篩選和小分子藥物高通量篩選，在開發(fā)自噬相關(guān)療法和監(jiān)測自噬調(diào)節(jié)藥物效果方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 溶酶體極性依賴熒光染料Lyso-OC

溶酶體和自噬溶酶體具有不同的極性。雙光子熒光探針Lyso-OC由極性依賴性熒光香豆素和溶酶體靶向的嗎啉組成，可特異性標(biāo)記活細(xì)胞溶酶體。Lyso-OC在波長760 nm處雙光子激發(fā)之下，在溶酶體中發(fā)射490～550 nm的亮綠色熒光。當(dāng)溶酶體和自噬體融合后，具有極性依賴性的香豆素?zé)晒獯銣鐬闇\綠色。

Lyso-OC探針幾乎沒有細(xì)胞毒性，在MCF-7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HELF細(xì)胞和CHO細(xì)胞等多種細(xì)胞系中顯示出良好的適用性，通過激光共聚焦成像可實(shí)時(shí)監(jiān)測活細(xì)胞自噬過程，也可用流式細(xì)胞術(shù)做高通量篩選。但在使用過程中應(yīng)排除其他細(xì)胞過程及溶酶體營養(yǎng)因子、自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑對溶酶體極性的影響[33],且要區(qū)分微自噬和巨自噬，還應(yīng)同時(shí)檢測其他自噬標(biāo)記蛋白，如LC3/p62等。

總之，自噬參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，為當(dāng)前科研工作的熱點(diǎn)[3-5]。因其呈多步驟、動(dòng)態(tài)性，自噬通量的準(zhǔn)確檢測也是科研工作的難點(diǎn)。當(dāng)前，以自噬標(biāo)記性蛋白LC3和溶酶體依賴性探針為代表的熒光探針在自噬檢測中廣泛應(yīng)用[6]。探針研發(fā)也從單熒光蛋白探針發(fā)展到雙熒光蛋白探針、含自身內(nèi)對照的新型雙熒光蛋白探針以及特異性定位不同細(xì)胞器以檢測選擇性自噬的熒光探針；從體外實(shí)驗(yàn)的熒光探針發(fā)展到通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物模型中表達(dá)以檢測在體自噬的探針。但每種探針均有其優(yōu)點(diǎn)和不足。國內(nèi)外自噬研究中均有因?yàn)闆]有考慮到所使用探針的局限性使自噬檢測不夠精準(zhǔn)，甚至因探針構(gòu)建、選用等問題造成結(jié)果難以解釋或者謬誤。

因此在自噬研究中，不僅要根據(jù)各熒光探針的適用范圍和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行合理選擇，往往還要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和目的在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和步驟，聯(lián)合應(yīng)用多種檢驗(yàn)和分析方法進(jìn)行檢測，如利用電子顯微鏡檢測特定時(shí)間點(diǎn)自噬結(jié)構(gòu)、利用免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、P62的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)合理設(shè)置對照組以及聯(lián)用自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑等，這樣才能更準(zhǔn)確和更全面地反映細(xì)胞的自噬強(qiáng)度。