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    血清HBV RNA在慢性乙型肝炎核苷(酸)類似物治療停藥中的作用

    2021-03-26 07:16:14王揚鄭素軍段鐘平
    肝臟 2021年1期
    關(guān)鍵詞:病毒學(xué)定量標(biāo)志物

    王揚 鄭素軍 段鐘平

    核苷(酸)類似物(NAs)作用于HBV聚合酶區(qū),抑制HBV復(fù)制,廣泛應(yīng)用于慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒治療,長期治療可以改善肝臟組織學(xué)病變并降低肝癌發(fā)生風(fēng)險。但是,由于cccDNA在感染肝細(xì)胞核內(nèi)的持續(xù)存在,HBV感染并不能被完全清除[1]。然而,相關(guān)研究表明[2],NAs長期治療可能減少含pgRNA的衣殼進入肝細(xì)胞核對cccDNA儲存庫進行補充,cccDNA會逐步耗竭,NAs每治療一年可能使cccDNA定量下降約1 log值,因此長期治療最終實現(xiàn)停藥具有理論可行性。臨床實踐中,部分患者停藥后發(fā)生病毒反彈,監(jiān)測cccDNA水平可以為NAs安全停藥提供有益的幫助。但是,一方面由于肝組織活檢的侵襲性,肝內(nèi)cccDNA定量檢測作為常規(guī)檢測并不現(xiàn)實,另一方面,cccDNA檢測缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的量化方法,而且操作過程復(fù)雜繁瑣,因此有必要開發(fā)無創(chuàng)性的替代標(biāo)記物來監(jiān)測cccDNA的數(shù)量或活性。越來越多的研究表明,血清HBV RNA可以作為反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的一個新的生物標(biāo)記物,尤其在HBV DNA檢測不出的CHB患者更是彰顯了其優(yōu)越性。本文就血清HBV RNA在CHB患者NAs治療停藥中的潛在應(yīng)用價值作一綜述。

    一、HBV RNA在病毒生命周期中的來源及功能

    HBV生命周期開始于病毒與肝細(xì)胞表面?;悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運多肽(NTCP)受體結(jié)合,將含有松弛環(huán)狀DNA(viral relaxed circular DNA, rcDNA)的核衣殼釋放到肝細(xì)胞內(nèi),rcDNA進一步被運輸?shù)郊?xì)胞核,進而被轉(zhuǎn)化成核小體修飾的cccDNA。cccDNA作為病毒轉(zhuǎn)錄模板,產(chǎn)物包括3.5 kb的PreC mRNA(pcRNA)和前基因組RNA(pgRNA),2.4 kb和2.1 kb的S mRNA以及0.7 kb的X mRNA。

    pgRNA是乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄的模板。在衣殼內(nèi),聚合酶將pgRNA反轉(zhuǎn)錄為rcDNA,然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上由包膜蛋白包裹后,分泌病毒顆粒至細(xì)胞外,或重新進入細(xì)胞核補充cccDNA儲存池。除rcDNA外,病毒反轉(zhuǎn)錄還可以產(chǎn)生雙鏈線性DNA,這種DNA可以作為病毒DNA分泌,也可以進入細(xì)胞核形成cccDNA。有研究表明,雙鏈線性DNA可以隨機整合到宿主基因組中,致使染色體不穩(wěn)定性增加、HBV基因和HCC相關(guān)宿主基因發(fā)生插入性突變,促進HCC的發(fā)生[3-4]。整合的HBV DNA雖然不能產(chǎn)生具有病毒復(fù)制能力的pgRNA,但是可以作為S mRNA的轉(zhuǎn)錄來源,增加HBsAg的表達(dá)水平[5]。

    血清和配對肝組織中HBV RNA深度測序結(jié)果表明,病毒準(zhǔn)種之間的復(fù)雜性和平均遺傳距離非常相近[6],提示血清中的HBV RNA可能來自受感染的肝細(xì)胞,但是HBV RNA進入循環(huán)的機制尚未完全清楚。為了確認(rèn)外周檢測到RNA的種類,Wang等[7-8]設(shè)計的RT-PCR分別檢測總HBV RNA和3.5kb RNA,結(jié)果提示二者拷貝數(shù)近似,進一步設(shè)計3.5kb HBV RNA和pcRNA特異性引物后擴增,排除pcRNA后結(jié)果與此類似,證實外周檢測到的HBV RNA主要來源于pgRNA,并進一步證實pgRNA主要以片段化或剪接體形式存在。同時也有研究結(jié)果顯示[9-10],感染HBV的離體細(xì)胞可以分泌大量無包膜蛋白的裸衣殼,其中包括有pgRNA在內(nèi)所有類型的復(fù)制中間產(chǎn)物。pgRNA反轉(zhuǎn)錄為rcDNA,包被表面蛋白后以Dane顆粒的形式分泌到外周血中,但同時也有研究發(fā)現(xiàn)[11],部分含pgRNA的衣殼能夠在成熟前釋放到外周血中,可能是宿主對抗HBV感染的防御機制之一。因此,需要更多的研究來描述HBV RNA病毒顆粒在慢性HBV感染中的生物學(xué)機制。

    二、血清HBV RNA在NAs停藥中作用研究

    國際主流的HBV管理指南對于NAs停藥的推薦建議包括[12-14]:無肝硬化HBeAg陰性患者治療至少2~3年,達(dá)到持續(xù)的病毒抑制;對于HBeAg陽性者發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換、HBV DNA持續(xù)監(jiān)測陰性且經(jīng)至少12個月鞏固治療,停藥后均需密切監(jiān)測隨訪。但是,這些推薦建議并不一致并且遠(yuǎn)未滿足臨床實踐需求。

    HBV RNA是從cccDNA轉(zhuǎn)錄而來,所以理論上HBV-RNA的水平可能可直接反映cccDNA水平。既往的小隊列研究結(jié)果表明[7,15-17],外周循環(huán)HBV RNA與肝細(xì)胞中的cccDNA存在正相關(guān),可被視為cccDNA的替代標(biāo)志物,有可能用于預(yù)測治療后的應(yīng)答及指導(dǎo)NAs的安全停藥。Masataka等在36例患者的隊列研究中[18],應(yīng)用NAs平均治療時間36周,停藥24周后,52.8%(19/36)的患者出現(xiàn)病毒學(xué)反彈,多變量分析結(jié)果表明,治療第3個月的HBV DNA+RNA滴度與病毒學(xué)反彈獨立相關(guān)(OR:9.474,P=0.043)。國內(nèi)Wang等在33例患者的隊列研究中[7],所有患者治療結(jié)束時HBV DNA檢測不出,停藥后隨訪24周,HBV RNA陽性患者發(fā)生病毒學(xué)反彈比率顯著高于HBV RNA陰性患者,且二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(21/21, 100%比3/12, 25%;P=0.001),推測HBV RNA水平可能與NAs停藥后的病毒學(xué)反彈相關(guān)并且可能成為安全停藥的生物學(xué)標(biāo)志物。

    Fan等[19]多中心、前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn),在評估隊列中,HBeAg(+)患者在NAs治療結(jié)束4年后,HBV DNA和HBV RNA(DNA-/RNA-)雙陰性的患者臨床復(fù)發(fā)(定義為HBV DNA>2 000 IU/mL并且ALT>2 ULN)風(fēng)險,顯著低于HBV DNA或HBV RNA單陽性的患者(分別為2/35, 8%和32/102, 31.4%,P=0.018)。在驗證隊列,隨訪5.5年,DNA-/RNA-雙陰性的患者臨床復(fù)發(fā)風(fēng)險仍然低于HBV DNA或HBV RNA單陽性的患者(分別為2/13, 15.4%和9/27, 33.3%,P=0.286),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果提示,HBV RNA陰性患者復(fù)發(fā)風(fēng)險明顯低于HBV RNA陽性患者人群。進一步多變量分析發(fā)現(xiàn),HBV DNA和RNA水平是臨床復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子,HBV DNA或HBV RNA任一陽性患者的臨床復(fù)發(fā)風(fēng)險為DNA-/RNA-雙陰性患者的4.54倍(95%CI:1.09~19.00,P=0.038)。這些分析表明,非肝硬化HBeAg(+)患者HBV核酸雙重陰性是指導(dǎo)NAs停藥的有效生物標(biāo)記物。作者同時比較了停藥時HBV RNA、HBV DNA和HBsAg定量預(yù)測臨床復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積,發(fā)現(xiàn)HBV RNA分別高于HBV DNA和HBsAg定量(三者分別為0.732、0.630和0.543),故作者建議未來研究使用HBV總核酸水平(總HBV DNA和RNA)作為指導(dǎo)HBeAg(+)患者NAs停藥的生物標(biāo)志物。

    三、血清HBV RNA與其他NAs停藥潛在標(biāo)志物的相關(guān)性

    目前認(rèn)為有潛在價值的停藥標(biāo)志物包括cccDNA、HBV DNA、HBsAg、HBcrAg、anti-HBc等。理論上,初治患者血清中HBV DNA和RNA均可反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性,然而CHB患者在NAs治療后,pgRNA反轉(zhuǎn)錄被抑制,HBV DNA水平下降,而RNA卻長期持續(xù)存在,這使其成為比HBV DNA更有效、更直接反映cccDNA活性的標(biāo)志物。Wang等的體外研究中,血清HBV RNA與cccDNA水平顯著相關(guān),而Allweiss等使用PegIFN降低cccDNA活性后發(fā)現(xiàn),二者不具有顯著的相關(guān)性,作者認(rèn)為二者相關(guān)性可能受到HBeAg狀態(tài)的影響[16,20]。國內(nèi)張文宏等[6]的研究中,患者血清HBV RNA與cccDNA水平無顯著相關(guān),但與肝內(nèi)HBV RNA/cccDNA比值顯著相關(guān),推測血清HBV RNA水平更多反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性,而非數(shù)量上的相關(guān)。

    血清HBV RNA與多個病毒學(xué)標(biāo)志物均存在不同程度的相關(guān)性。多個研究表明,未經(jīng)治療患者血清HBV RNA與HBV DNA之間存在高度的線性正相關(guān)[21-23]。van Bommel等[24]同時證明,NAs治療后血清HBV RNA與HBV DNA仍然相關(guān),但相關(guān)性較前減弱。在未經(jīng)治療患者中,有研究顯示HBeAg陰性患者血清HBV RNA和DNA的相關(guān)系數(shù)高于HBeAg陽性患者(r=0.741和r=0.532,P<0.001)[25]。但van Campenhout等[26]認(rèn)為HBV RNA與DNA之間的相關(guān)性在HBeAg陽性和陰性患者中類似。這種差異可能是樣本量、患者臨床特征差異或采用的HBV RNA定量方法不同導(dǎo)致。

    血清中HBV RNA與HBsAg定量之間的相關(guān)性,目前研究結(jié)果尚存在分歧。有研究表明,HBV RNA與HBsAg之間存在顯著的線性正相關(guān),但在HBeAg陰性患者亞組分析中,這種線性相關(guān)性未得到進一步確認(rèn)[22]。而在新近的研究中,HBV RNA與HBsAg之間的線性相關(guān)性未能得到進一步的證實[27],這種差異可能是由于樣本量或是患者異質(zhì)性導(dǎo)致。一項納入11項研究、含1 716例患者來研究HBsAg定量在NAs停藥中的作用,薈萃分析結(jié)果表明[28],NAs中位治療時間及鞏固治療時間分別為56.12個月和36.7個月,停藥12月后,HBsAg定量<100 IU/mL和>100 IU/mL患者的病毒學(xué)反彈率分別為9.1%~19.6%和31.4%~63.6%,隨訪39個月后,HBsAg陰轉(zhuǎn)比率分別為21.1%~58.8%和3.3%~7.4%。

    新近有研究表明[29],外周循環(huán)中HBcrAg水平可以作為指導(dǎo)NAs停藥的新型生物標(biāo)志物。究其原因,一方面HBcrAg檢測包含核心抗原、HBeAg和22 kDa截斷的前核心蛋白的總和,有研究認(rèn)為其與cccDNA的相關(guān)性優(yōu)于HBV RNA和HBsAg[30],另一方面,有研究表明NAs治療過程中,血清HBcrAg和HBV RNA水平顯著正相關(guān)并且具有類似的下降特征[27],同時在HBeAg陰性患者中,停止治療時HBcrAg>3.7 log IU/mL患者,停藥1年病毒學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險較低水平患者增加3.7倍(95%CI:1.187~11.856; P =0.024)[31]。Ivana等[1]研究19例NAs長期治療達(dá)到HBsAg陰轉(zhuǎn)后停藥患者的隨訪顯示,11%(2/19)患者停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)反彈,停藥前及停藥后2例患者均檢測不出HBcrAg,但在停藥時仍可檢測到pgRNA,停藥后pgRNA水平進一步升高,提示HBV RNA指導(dǎo)停藥較HBcrAg可能更有優(yōu)勢,但樣本量明顯較少。抗-HBc定量在停藥中的研究較少,Heng等研究顯示[32],100例患者NAs停藥后隨訪1.0~3.5年,39例患者發(fā)生臨床復(fù)發(fā),高滴度抗-HBc患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險比是低滴度患者的0.31倍(95%CI:0.15~0.65,P=0.002)??傊?,究竟哪一個標(biāo)志物對停藥后的應(yīng)答預(yù)測更優(yōu)、現(xiàn)有標(biāo)志物如何聯(lián)合使用及其價值有待于進一步研究確認(rèn)。

    NAs安全停藥是CHB管理中的研究熱點之一。雖然完全清除cccDNA的療法可能會在不久的將來出現(xiàn),但目前的臨床實踐中同樣需要簡單易行、安全的停藥標(biāo)準(zhǔn)。目前的臨床研究提出了包括HBV RNA在內(nèi)等潛在可能用于臨床實踐的生物學(xué)標(biāo)志物,然而,目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法或可用的商品化檢測試劑盒,其次,盡管決定HBV RNA水平的主要因素是cccDNA水平,但血清中HBV RNA水平仍然可能受HBV感染階段、病毒基因型和pgRNA剪接變異體等因素的影響[10]。聯(lián)合檢測HBcrAg、HBsAg、抗-HBc和HBV RNA定量,并優(yōu)化其組合方案來指導(dǎo)安全停藥仍需要進一步研究。

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