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    油菜黑脛病菌T-DNA插入致病力減弱突變體的篩選及側(cè)翼序列分析

    2021-03-26 08:08:28皇甫海燕史志丹郝麗芬燕孟嬌宋培玲楊永青賈曉清皇甫九茹李子欽
    華北農(nóng)學報 2021年1期
    關(guān)鍵詞:突變體油菜菌落

    皇甫海燕,史志丹,郝麗芬,燕孟嬌,宋培玲,楊永青,賈曉清,皇甫九茹,郭 晨,李子欽

    (內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院 植物保護研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

    油菜黑脛病(Blackleg),是由黑脛病菌(Leptosphaeriabiglobosa)病原真菌引起的一種真菌病害[1],可危害油菜的葉片、莖稈、角果等組織[2],導(dǎo)致我國油菜產(chǎn)量損失、品質(zhì)下降[3-4]。目前,我國已經(jīng)開展了油菜Leptosphaeriabiglobosa的生物學特性[5-6]、侵染條件和途徑[7]、遺傳多樣性[8]、致病力分化[9]等方面的研究,但還未見關(guān)于黑脛病菌致病機制研究的報道。

    T-DNA插入目的基因的突變體技術(shù)是將T-DNA片段隨機插入病原菌基因組引起某段基因突變,從而造成該基因功能缺失,進而通過表型變化來解析目的基因功能的方法[10]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation,ATMT)是應(yīng)用最為廣泛的T-DNA突變體技術(shù),該方法具有插入拷貝數(shù)少、轉(zhuǎn)化效率高[11]、操作簡便并易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子等特點[12]。利用該方法構(gòu)建突變體庫,從中篩選獲得致病力減弱的突變體,通過對病原菌的表型鑒定和分析插入位點的側(cè)翼序列,確定發(fā)生突變的基因,分離和研究病原菌致病相關(guān)基因及其功能[13]。目前T-DNA 插入位點側(cè)翼序列的擴增多采用半隨機引物PCR法,主要包括:熱不對稱交錯PCR法(TAIL-PCR)、高效熱不對稱交錯PCR(Hi TAIL-PCR)、限制位點PCR(Restriction-site PCR,RSPCR)、單寡核苷酸巢式PCR(Single oligonucleotidenested PCR,SON-PCR),其中前2種方法應(yīng)用較多[14]。因此,本研究從T-DNA插入Leptosphaeriabiglobosa突變體庫中,篩選致病力減弱的突變體,并對其表型特征進行觀察,隨后利用Hi TAIL-PCR擴增其側(cè)翼序列,通過GenBank上Blast比對序列,初步確定了致病力減弱突變體的T-DNA插入位點側(cè)翼序列,為進一步篩選Leptosphaeriabiglobosa致病基因提供研究基礎(chǔ),并為其致病機制的研究提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 植物材料、菌株及質(zhì)粒 供試甘藍型油菜品種為青雜5號;野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所保存。Leptosphaeriabiglobosanm-1T-DNA突變體庫由雙元載體pCH-sGFP-GUS作為轉(zhuǎn)化供體所得,其中pCH-sGFP質(zhì)粒由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學趙君教授惠贈。

    1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶PstⅠ,DNA瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒,CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒,購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司;地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ(化學發(fā)光法),PCR DIG Probe Synthesis Kit,購自Roche公司;HyBond N+正電荷尼龍膜,購自Amersham公司;引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 致病力減弱突變體的篩選 基于前期試驗,構(gòu)建獲得T-DNA突變體庫[15-16],從中隨機挑取16株單孢分離后的突變體菌株,以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1為對照,接種于PDA平板上,25 ℃培養(yǎng)12~15 d,刮取分生孢子,制備孢子懸浮液,將濃度調(diào)至0.2×106個/mL后備用。采用穿刺接種法[17]對突變體的致病性進行鑒定,具體是將10 μL的孢子懸浮液接種于油菜子葉上,每個突變體最少接種10片子葉,12 d后調(diào)查油菜的發(fā)病情況及病情指數(shù),篩選出致病力減弱突變體,重復(fù)3次。

    1.2.2 致病力減弱突變體菌落形態(tài)及生長速率測定 調(diào)查不同突變體菌株的致病力,挑選出致病力下降程度大的突變體菌株,以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對照,將菌餅(Φ=3.5mm)轉(zhuǎn)接在PDA上,25 ℃培養(yǎng)7 d后,觀察其菌落形態(tài),并拍照記錄,同時測量菌落直徑,計算菌絲生長速率(cm/d),重復(fù)3次。

    1.2.3 致病力減弱突變體菌株產(chǎn)孢量的測定 將以上挑選的致病力減弱突變體,以Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對照,PDA上25 ℃培養(yǎng)14 d后,獲得分生孢子懸浮液后,利用血球計數(shù)板計數(shù),計算其產(chǎn)孢量,重復(fù)3次。

    1.2.4 致病力減弱突變菌株的Southern Blot檢測 CTAB法提取致病力減弱突變體和Leptosphaeriabiglobosanm-1基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切,電泳后轉(zhuǎn)到尼龍膜上,采用紫外交聯(lián)儀將核酸固定。再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標記探針進行雜交,雜交完成后進行洗膜及信號檢測。

    1.2.5 T-DNA插入側(cè)翼序列的克隆、測序和分析 利用高效熱不對稱交錯PCR(Hi TAIL-PCR)擴增T-DNA插入側(cè)翼序列,簡并引物為LAD1~LAD5;特異性嵌套引物為RB1~RB3(表1),與通用簡并引物LAD和接頭序列AC組合,以野生型菌株和致病力減弱突變體菌株基因組DNA 為模板進行3 輪Hi TAIL-PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序參照文獻[18],將第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收、TA 克隆,挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast查詢比對。

    表1 Hi TAIL-PCR擴增側(cè)翼序列引物Tab.1 Primers for amplifying flanking sequence by Hi TAIL-PCR

    2 結(jié)果與分析

    2.1 致病力減弱突變菌株的獲得

    測定16株突變體菌株的致病力(圖1),野生型菌株Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對照,其中3株突變體菌株的相對病情指數(shù)顯著高于對照(P>0.05),分別是T17、T18、T21。12株突變體菌株的相對病情指數(shù)比對照小,分別為T1、T3、T4、T5、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T13、T14。其中野生型菌株nm-1病情指數(shù)為48.6,突變體T1的病情指數(shù)為35.5,T3為32.5,T4為31.3,T5為41.3,T7為35.3,T8為42.3,T9為31.0,T10為42.5,T11為25.4,T12為46.3,T13為44.6,T14為37.8,分別降低了27.0%,33.2%,35.8%,15.0%,27.4%,36.2%,13.0%,36.2%,12.6%,47.7%,8.2%,22.2%。與野生型菌株nm-1相比,T1、T3、T4、T5、T7、T9、T11、T14這8株突變體菌株的致病力顯著降低(P<0.05),為致病力減弱菌株。

    2.2 致病力減弱突變體的菌落形態(tài)特征

    通過上述試驗,最后篩選出6個致病力減弱突變體(T1、T3、T4、T7、T9、T11、T14),培養(yǎng)7 d后,對這些突變體的菌落形態(tài)進行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變體T1、T3、T4、T7與野生型菌株nm-1菌落形態(tài)相比基本沒有差異,而突變體T9、T11菌絲形態(tài)致密,緊致,沒有產(chǎn)生孢子,與野生型菌株nm-1相比,具有較大差異(圖2)。

    2.3 致病力減弱突變體的生長速率

    培養(yǎng)7 d后,對致病力減弱的6個致病力減弱突變體的生長速率進行測定(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn),6個致病力減弱突變體T1、T3、T4、T7、T9的生長速率較快,分別為0.68,0.69,0.68,0.60,0.67 cm/d。與野生型菌株nm-1(0.59 cm/d)相比,差異不顯著(P>0.05),只有突變體T11生長速率為0.32 cm/d,與野生型菌株nm-1相比顯著下降(P<0.05),下降了23.7%。

    2.4 致病力減弱突變體的產(chǎn)孢量

    培養(yǎng)14 d后,測定6株致病力減弱突變體的產(chǎn)孢量(圖4),T1、T3、T4、T7、T9、T11的產(chǎn)孢量分別為0.46×106,0.50×106,1.38×106,1.24×106,0.40×106,0.51×106個/mL,與野生型菌株nm-1的產(chǎn)孢量(3.84×106個/mL)相比,都顯著下降(P<0.05),分別下降了87.9%,87.0%,64.1%,67.8%,89.6%,86.7%。

    2.5 致病力減弱突變體Southern Blot 檢測

    利用Southern Blot檢測突變體菌株(圖5),6個突變體的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切,與DIG標記探針雜交,均只有1個雜交信號,說明T-DNA以單拷貝形式插入到各突變體的基因組中。

    2.6 致病力減弱突變體側(cè)翼序列分析

    利用Hi TAIL-PCR技術(shù)對6株致病力減弱突變體插入位點的右翼序列進行PCR擴增,在第3輪PCR結(jié)束之后,得到了清晰的特異性條帶,大小在200~1 000 bp(圖6),經(jīng)回收、測序后,在GenBank上Blast比對分析,與Leptosphaeriabiglobosa的基因組scaffold 同源性達95.0%以上,獲得了T-DNA 具體的插入位置(表2),可以看出,T-DNA的插入位點與scaffold 的長度和位置沒有聯(lián)系,說明T-DNA 在基因組上的插入是隨機的。

    表2 T-DNA 插入位點序列分析Tab.2 Sequence analysis of T-DNA insertion site

    3 討論與結(jié)論

    目前,我國對于油菜黑脛病的防治,主要通過化學藥劑進行防治,還沒有黑脛病抗性品種。因此,篩選L.biglobosa致病基因及進一步研究L.biglobosa的致病機制,有助于認識和防治油菜黑脛病的發(fā)生,并為油菜抗黑脛病育種提供一定的理論基礎(chǔ)。目前,國內(nèi)尚未見有關(guān)L.biglobosa致病機制的研究報道,而獲得大量的突變體、鑒定突變體的表型特征、進行致病力及插入位點側(cè)翼序列的分析是病原菌致病機理研究的最佳方式。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入目的DNA,是篩選突變體的關(guān)鍵技術(shù)[19],對插入位點側(cè)翼序列的擴增分析,是致病基因克隆及基因功能研究的基礎(chǔ)[20]。本研究從已建立的L.biglobosa突變體庫中篩選致病力減弱的突變體,并對致病力顯著下降的突變體進行菌落形態(tài)觀察、生長速率和產(chǎn)孢量進行測定,發(fā)現(xiàn)這些突變體的菌落、菌絲形態(tài)、生長速率和分生孢子產(chǎn)孢能力出現(xiàn)變化,說明T-DNA插入在一定程度影響著L.biglobosa的生長發(fā)育,有可能影響了它的營養(yǎng)運輸,這也可能與致病力的減弱有關(guān),也說明T-DNA 的插入破壞了L.biglobosa致病相關(guān)基因的表達。這些突變體將為研究L.biglobosa致病相關(guān)基因克隆提供候選條件。

    另外,本研究應(yīng)用Hi TAIL-PCR技術(shù),經(jīng)過3輪PCR,克隆了6個致病力減弱的右側(cè)翼序列,6個側(cè)翼序列比對到L.biglobosabrassicae的scaffold基因組,這6條序列與L.biglobosabrassicae菌株基因組同源性均在95.0%以上。因為雖然有L.biglobosabrassicae菌株的全基因組測序序列,但由于基因組未進行注釋,比對結(jié)果只能獲得T-DNA 插入位點。下一步工作將采用RACE-PCR,根據(jù)側(cè)翼基因片段,克隆L.biglobosa致病力減弱側(cè)翼基因全長,然后通過基因敲除突變體對其功能及致病機理作進一步研究。本研究初步明確了T-DNA 插入油菜黑脛病菌L.biglobosa位置。為下一步致病基因的克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ),也為致病機理的研究提供參考。

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