圍產(chǎn)期奶山羊注射5-HTP后血液ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

胡凱召,趙海瑛,陳順新,杜 瑋,高慧杰,鄭惠玲

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

奶山羊在產(chǎn)羔前后兩周內(nèi)的奶山羊由于產(chǎn)道收縮和形成初乳，會消耗掉血液中大量的鈣離子，造成血液中的鈣離子濃度迅速降低，極易引發(fā)低血鈣癥[1]。并伴隨著產(chǎn)后癱瘓、乳腺炎、酮病、胎衣不下等疾病[2]，對奶山羊產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在外周組織中，L-色氨酸在色氨酸羥化酶(Tryptophan Hydroxylase 1，TPH1)的作用下生成5-HTP，5-HTP在芳香族氨基酸脫羧酶的作用下可以生成5-HT[3-4]。5-HT可以誘導(dǎo)甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Parathyroid Hormone-related Peptide，PTHrP)的表達(dá)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性[5]，溶解骨骼中的鈣釋放到血液中[6-7]。此外5-HT還可以誘導(dǎo)山羊乳腺上皮細(xì)胞中與鈣代謝有關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控山羊乳腺上皮細(xì)胞向乳汁中釋放鈣離子[8-9]。

人類基因組中只有2%的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本可以編碼蛋白質(zhì),其余98%的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本都沒有編碼蛋白質(zhì)的能力[10]，但近些年研究發(fā)現(xiàn)，這些非編碼轉(zhuǎn)錄本可以影響基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，調(diào)控編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)，對生物體的生理活動和代謝過程有著重要的調(diào)控作用。2011年Salmena等提出了ceRNA假說，該假說認(rèn)為在 ceRNA 網(wǎng) 絡(luò) 中 ，microRNA為核心元素，mRNA、LncRNA、CircRNA和假基因等作為ceRNA，通過競爭一個或多個microRNA應(yīng)答元件(microRNA Response Element,MRE)來調(diào)節(jié)其mRNA的表達(dá)，進(jìn)而行使調(diào)節(jié)功能[11]。進(jìn)而調(diào)控組織或細(xì)胞許多生理活動，包括細(xì)胞增殖凋亡、細(xì)胞遷移侵襲、脂代謝、糖代謝等[12-13]。

Lin等[14]在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)構(gòu)建的粥樣硬化模型中發(fā)現(xiàn)，LncRNA MKI67IP3可吸附Let-7e,進(jìn)而調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-KB(Nuclear Transcription Factor-KB,NF-KB)的表達(dá)，并在人動脈粥樣硬化斑塊組織中得到了驗(yàn)證。 第10染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因( Gene Of Phosphate And Tension Homology Deleted On Chromsome Ten ，PTEN)PTEN 是重要的抑癌基因，在黑色素瘤、前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 PTEN的ceRNA[15-16]。

本試驗(yàn)通過向圍產(chǎn)期的奶山羊注射5-HTP，提高奶山羊體內(nèi)5-HT的濃度，在分娩當(dāng)天采集血液后進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出差異表達(dá)的基因并作富集分析，篩選鑒定出差異表達(dá)的LncRNA、microRNA、CircRNA。構(gòu)建ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)中的基因作功進(jìn)行功能注釋與富集分析。最后篩選出與鈣離子代謝相關(guān)的LncRNA/CircRNA-microRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為5-HT調(diào)控山羊鈣代謝提供了一種全新的分子機(jī)制。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)樣本采集

從陜西省周至縣宏興奶山羊養(yǎng)殖基地選取6只體況良好、胎次相近，處于妊娠后期的奶山羊，分為2組，每組3只，預(yù)產(chǎn)期前7 d開始試驗(yàn)組靜脈注射濃度為0.8 mg/kg的5-HTP，另一組為對照組，注射等量生理鹽水。分娩當(dāng)天采集血液，使用Trizol試劑盒提取RNA。

1.2 構(gòu)建文庫與上機(jī)測序

1.2.1 small RNA文庫的構(gòu)建 RNA樣品檢測合格后按照small RNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建文庫，將RNA隨機(jī)打斷成片段，分別在RNA兩端連接測序接頭，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用凝膠分離技術(shù)篩選目標(biāo)片段，得到small RNA文庫。

1.2.2 LncRNA文庫的構(gòu)建 按照LncRNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建文庫，加入Fragmentation Buffer將mRNA隨機(jī)打斷成片段，加入隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈，然后合成第二條鏈。 用AMPure XP珠純化cDNA，之后加上測序接頭。通過PCR富集獲得cDNA文庫。

1.2.3 上機(jī)測序 測序由北京百邁克生物科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq平臺將構(gòu)建好的Small RNA、LncRNA文庫進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的鑒定

1.3.1 差異表達(dá)基因的篩選與分析 采用Trommatic對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，用HISAT2軟件將LncRNA文庫的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)與山羊參考基因組進(jìn)行比對，使用StringTie對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝，用FPKM值計(jì)算基因的表達(dá)量。用EBSeq軟件以log2Fold Change>1，F(xiàn)DR<0.05作為篩選的閾值篩選差異表達(dá)的基因。用Metascape(www.metascape.org)對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。

1.3.2 差異表達(dá)LncRNA的篩選 根據(jù)與參考基因組比對的結(jié)果，用StringTie軟件組裝轉(zhuǎn)錄本。采用CPC、CNCI、CPTA和Pfam結(jié)構(gòu)域分析估計(jì)候選LncRNA的編碼潛力。取4種分析方法不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本的交集為鑒定出的LncRNA。用StringTie軟件通過FPKM值計(jì)算 LncRNA的表達(dá)量，EBSeq軟件以log2Fold Change>1，F(xiàn)DR<0.05作為閾值篩選差異表達(dá)的LncRNA。

1.3.3 差異表達(dá)CircRNA的篩選 根據(jù)與參考基因組比較的結(jié)果，通過CIRI、find-Circ預(yù)測并鑒定CircRNA，用TPM值計(jì)算CircRNA的表達(dá)量，并用EBSeq軟件以Log2Fold Change> 1，F(xiàn)DR <0.05用作篩選的閾值來篩選差異表達(dá)CircRNA。

1.3.4 差異表達(dá)microRNA的篩選 對于Small RNA的文庫，用Bowtie軟件將測序數(shù)據(jù)與非編碼RNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，過濾掉非編碼RNA和重復(fù)序列，獲得包含microRNA的注釋序列。利用Bowtie軟件將注釋序列與參考基因組進(jìn)行序列比對，獲取在參考基因組上的注釋信息。將比對到參考基因組的序列與miRBase數(shù)據(jù)庫中的成熟microRNA序列進(jìn)行比對，序列相同的為已知microRNA。對于比對結(jié)果不相同的序列，用miRDeep2軟件進(jìn)行新microRNA的預(yù)測。同樣用TPM值計(jì)算microRNA的表達(dá)量，用EBSeq以 log2fold Change>1， FDR<0.05作為閾值篩選差異表達(dá)的microRNA。

1.4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

篩選差異表達(dá)的mRNA，microRNA，LncRNA，CircRNA和它們的序列，使用這些轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建LncRNA/CircRNA-microRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。使用RNAhybrid和RNA 22設(shè)置閾值來預(yù)測LncRNA、CircRNA與microRNA的結(jié)合情況。滿足這兩個軟件閾值的LncRNA-microRNA和CircRNA-mivroRNA調(diào)控關(guān)系被保留。對于microRNA-mRNA相互作用關(guān)系，使用miRanda設(shè)置閾值來預(yù)測它們之間的結(jié)合情況，滿足閾值的調(diào)控關(guān)系保留下來。選取LncRNA、/CircRNA與mRNA表達(dá)趨勢相同并與microRNA表達(dá)趨勢相反的調(diào)控關(guān)系作為最終的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后使用cytoscape3.6.1構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，對于ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的基因使用Metascape進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的篩選與鑒定

EBSeq軟件設(shè)置閾值log2fold Change>1、FDR<0.05來篩選差異表達(dá)的mRNA、microRNA、LncRNA和CircRNA，共獲得999個差異表達(dá)的mRNA，其中586個上調(diào)，413個下調(diào)。 篩選出667個差異表達(dá)的LncRNA，其中371個上調(diào)，296個被下調(diào)。 在87個差異表達(dá)的microRNA中，有46個上調(diào)， 41個下調(diào)。 最后，篩選出95個差異表達(dá)的CircRNA。 其中，有66個上調(diào)，有29個下調(diào)。

2.2 差異表達(dá)基因的富集分析

如圖1所示，山羊注射5-HTP后主要影響免疫反應(yīng)過程、無機(jī)離子穩(wěn)態(tài)和脂代謝。通過調(diào)控對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、白細(xì)胞遷移來影響免疫反應(yīng)過程。山羊注射5-HTP后會影響無機(jī)離子的穩(wěn)態(tài)，主要是體內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)。

圖1 差異表達(dá)基因富集分析Fig. 1 Enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

根據(jù)ceRNA的作用機(jī)制和RNAhybrid、RNA22和miRanda軟件，構(gòu)建了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖2)。對于CeRNA網(wǎng)絡(luò)中的這些mRNA，采用Metascape進(jìn)行富集分析。如圖3所示，通過LncRNA/CircRNA-microRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Ln-cRNA與CircRNA主要影響小分子的轉(zhuǎn)運(yùn)、無機(jī)離子(鈣離子)穩(wěn)態(tài)、白細(xì)胞介素-8的產(chǎn)生調(diào)節(jié)和水解酶的活性調(diào)節(jié)。富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR9、JPH1和GJC2與鈣代謝有關(guān)。TLR9可負(fù)調(diào)節(jié)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的活性。JPH1參與鈣釋放通道活性的調(diào)節(jié)、鈣離子釋放到胞質(zhì)溶膠中，GJC2與鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)正調(diào)節(jié)有關(guān)。LncRNAMSTRG.1354.2可以與TLR9競爭性的結(jié)合microRNA NC_0308251_46027，從而調(diào)節(jié)TLR9的表達(dá)。TLR9可以影響鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的活性，基于這一作用機(jī)制，LncRNA可以參與調(diào)控鈣代謝，其他的調(diào)控關(guān)系也是類似的。

3 討 論

Laporta等[17]使用野生型小鼠、TPH1基因敲除小鼠和TPH1基因敲除后注射5-HTP的乳腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，與TPH1基因敲除的小鼠相比，野生型小鼠增加了5-HT的含量，注射5-HTP后同樣增加小鼠體內(nèi)5-HT的濃度。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，野生型相對于其它兩組鑒定出62個共同差異表達(dá)的基因，進(jìn)行富集分析結(jié)果表明，增加小鼠體內(nèi)5-HT的濃度后，主要影響鈣穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝和細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)等過程。這與本試驗(yàn)差異表達(dá)基因的富集分析結(jié)果基本上是一致的，證實(shí)了采用轉(zhuǎn)錄組測序分析的方法來探究5-HT的生物學(xué)功能是可靠的。除此之外，還表明盡管小鼠和山羊是兩個不同的物種，但是在兩個物種之間一些基因是保守的，并且它們的表達(dá)都受5-HT濃度的影響。

Weaver等[18]研究發(fā)現(xiàn)通過注射或飼喂5-HT的前體物質(zhì)可增加奶牛體內(nèi)5-HT的濃度，5-HT的濃度與奶牛泌乳第一天血清中鈣的濃度呈正相關(guān)。Zang等[9]在山羊乳腺上皮細(xì)胞中用干擾TPH1和添加5-HTP來減少或增加5-HT的濃度，發(fā)現(xiàn)5-HT可以促進(jìn)PTHrP的表達(dá)，并以劑量依賴性的方式促進(jìn)鈣敏感受體(Calcium Sensing Re-ceptor,CASR)的表達(dá)，降低鈣轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)膜ATP酶1(ATPase Plasma Membrane Ca2+Transporting 1，ATP2B1)的表達(dá)。這些研究都發(fā)現(xiàn)5-HT可以顯著的影響血清中的鈣離子濃度，參與鈣代謝，并且影響與鈣代謝相關(guān)基因的表達(dá)。這進(jìn)一步印證了注射5-HTP后轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果。

Watanabe等[19]的綜述中指出腸道的腸嗜鉻細(xì)胞在餐后產(chǎn)生5-HT。 在小鼠中，它通過對幾種5-HT受體的作用，誘導(dǎo)脂質(zhì)濃度降低。此外5-HT通過5-HT受體2A和2C加速脂肪細(xì)胞的分化。進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)代謝。5-HT可以調(diào)控許多免疫細(xì)胞的儲存、反應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)。包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血小板，尤其是T細(xì)胞[20]。圍產(chǎn)期的奶山羊注射5-HTP后還影響脂代謝和免疫反應(yīng)過程，這與本研究富集分析的結(jié)果是一致的，印證轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果，5-HT確實(shí)可以調(diào)控脂代謝和免疫反應(yīng)。5-HT可以通過與其受體作用，激活或抑制細(xì)胞內(nèi)的信號通路，從而調(diào)控脂代謝和免疫反應(yīng)過程[21]。

A

B

Wang等[22]用GEO數(shù)據(jù)庫中動脈粥樣硬化模型的巨噬細(xì)胞和正常的巨噬細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，鑒定出差異表達(dá)的LncRNA、CircRNA、microRNA、mRNA，并且構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircRNA hsa_circ_0028198、hsa_circ_0092317和LncRNAXIST可與天冬氨酸β-羥化酶 (Aspartate Beta-Hydroxylase，ASPH)競爭性地結(jié)合miR-543，APSH通過與鈣電壓門控通道輔助亞基α2δ4 (Calcium Voltage-gated Channel Auxiliary Subunit alpha2 delta 4，CACNA2D4)參與鈣代謝。

圖3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的基因富集分析Fig3. Enrichment analysis of the genes in the ceRNA network

CircRNA和LncRNA的最重要機(jī)制之一是通過吸附microRNA來阻止microRNA對靶基因的抑制。特定基因的表達(dá)受LncRNA / CircRNA-microRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，進(jìn)而影響生物學(xué)過程[23-25]。然而，在本研究構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，CircRNA不能調(diào)控與鈣代謝有關(guān)的基因。2 個LncRNA通過與microRNA競爭性地結(jié)合鈣代謝相關(guān)的基因來調(diào)控鈣代謝。LncRNA與CircRNA通過ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)行使調(diào)控基因表達(dá)的作用，進(jìn)而調(diào)控鈣代謝等過程，闡述了一種調(diào)控基因表達(dá)的新機(jī)制。這些分子機(jī)制有待進(jìn)一步細(xì)胞分子試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

對注射和不注射5-HTP的圍產(chǎn)期奶山羊的血液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)基因主要參與鈣代謝、脂質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過程。構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)TLR9、GJC2和JPH1 3個與鈣代謝相關(guān)的基因，LncRNA MSTRG.1354.2可與TLR9競爭性地結(jié)合 microRNA NC.030825.1_6027,進(jìn)而調(diào)控TLR9的表達(dá)，MSTRG.56601.1和MSTRG.101405.3都可以與GJC2、JPH1競爭性地結(jié)合NC.030814.1_19917，進(jìn)而調(diào)控GJC2和JPH1的表達(dá)。本研究為圍產(chǎn)期山羊鈣代謝調(diào)控提供了一種全新的分子機(jī)制，為尋找新的防治圍產(chǎn)期奶山羊低血鈣癥的有效方法提供了新思路。