四川地區(qū)藜麥葉斑病病原菌的分離及鑒定

廖映凱　羅吉　許芮涵　芶琳　邱愛東

摘要： 通過篩查并鑒定四川地區(qū)藜麥葉斑病的致病菌，旨在為后續(xù)研發(fā)生物防治制劑提供理論依據(jù)。分別采集成都金堂、十陵和西昌等種植基地患有藜麥葉斑病的植株。經(jīng)組織分離、平板純化分離菌株，并采用科赫法則確定致病菌;擴大培養(yǎng)致病菌菌株，提取其DNA，用rDNA-ITS（rDNA-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）、16S rDNA通用引物進行PCR擴增測序，對測序結(jié)果進行BLAST比對，并用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，分離篩選到的2株細菌菌株SCCDP-2、SCCDP-4能夠?qū)е滤拇ǖ貐^(qū)藜麥葉斑病的發(fā)生，經(jīng)鑒定為成團泛菌（Pantoea agglomerans）。

關(guān)鍵詞： 藜麥葉斑病;病原菌;鑒定

中圖分類號： S432.4+2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0060-07

Isolation and identification of leaf spot disease pathogen of Chenopodium quinoa in Sichuan

LIAO Ying-kai1， LUO Ji1， XU Rui-han1， GOU Lin2， QIU Ai-dong1

（1.School of Pharmacy and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China;2.College of Life Science， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract： The pathogenic bacteria of Chenopodium quinoa leaf spot disease in Sichuan were screened and identified to provide theoretical basis for subsequent development of biological control agents. The plants infected with C. quinoa leaf spot disease were collected from Jintang， Shiling and Xichang planting bases in Chengdu. The strains were isolated by tissue isolation and plate purification， and the pathogenic bacteria were determined according to Kochs postulates. The pathogenic strains were further cultivated， and its DNA was extracted. The universal primers of rDNA-ITS and 16S rDNA were used for PCR amplification and sequencing， and the sequencing results were compared by BLAST. In addition， MEGA 4.0 was used to build phylogenetic trees. The results showed that the isolated and screened two strains SCCDP-2 and SCCDP-4 could cause the occurrence of C. quinoa leaf spot disease in Sichuan， and the two strains were identified as Pantoea agglomerans.

Key words： leaf spot disease of Chenopodium quinoa;pathogenic bacteria;identification

藜麥（Chenopodium quinoa）是藜科藜屬植物，原產(chǎn)于南美洲的安第斯山高原地區(qū)，具有5 000～7 000年的種植歷史[1]。藜麥具有很高的營養(yǎng)價值，被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦為適宜人類食用的“全營養(yǎng)食品”，其蛋白質(zhì)含量顯著高于水稻和玉米，達到16%～30%，此外，藜麥的必需氨基酸比例較均衡，并且極易被人體吸收[2-4]。20世紀80年代末，藜麥被引入中國西藏地區(qū)進行試種研究，2008年以后開始得到大規(guī)模引種[5]。隨著種植規(guī)模的擴大，藜麥病害愈發(fā)突顯，從而嚴重影響了其產(chǎn)量，尤其在四川地區(qū)，藜麥葉斑病的發(fā)病率約為40%，在嚴重的地塊甚至達到80%?；疾∞见溔~片上出現(xiàn)壞死病灶，呈斑點狀，中間淺黃色，邊緣褐色，外圍有褪綠暈圈，嚴重時可導(dǎo)致藜麥死亡。本研究對四川地區(qū)藜麥葉斑病患病植株進行采樣及病原菌分離，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合rDNA-ITS（rDNA-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）、16S rDNA序列分析，對藜麥葉斑病致病菌進行系統(tǒng)鑒定，以期為藜麥葉斑病的后續(xù)生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病菌標本的采集

2019年5月在四川省成都市龍泉驛區(qū)、成都市金堂縣、西昌市美姑縣、涼山彝族自治州鹽源縣藜麥種植基地采集藜麥葉斑病的新鮮患病植株。

1.2 試劑

葡萄糖、無水乙醇、次氯酸鈉、瓊脂、巰基乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純，胰蛋白胨、酵母提取物均購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司，DNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)公司。

1.3 引物

rDNA-ITS、16S rDNA通用引物序列由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成，詳見表1。

1.4 試驗方法

1.4.1 病原菌的分離 選取有典型葉斑病癥狀的藜麥葉片，用組織分離法分離病原菌[6]。用無菌水沖洗病株葉片后，將葉片放入75%乙醇中浸泡35 s，再用0.2%次氯酸鈉浸泡60 s，隨后用無菌水沖洗3次，最后將葉片置于無菌濾紙上晾干。將用上述方法處理的葉片切塊后置于LB、PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落，反復(fù)純化得到純菌株。

1.4.2 菌落的形態(tài)學(xué)觀察 將得到的純化菌株分別置于PDA、LB固體培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，肉眼觀察菌落的形態(tài)特征。對菌落進行革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)特征。

1.4.3 致病性鑒定 在溫室條件下栽培藜麥，當藜麥長至5～6葉期時，采用針刺接種法用分離純化得到的供試菌液（原菌液與無菌水的體積比為1∶5）分別接種葉片，以接種滅菌蒸餾水的處理作為對照。每天觀察藜麥葉片的生長狀態(tài)，從患病葉片中再次分離篩選菌株。根據(jù)柯赫法則，重復(fù)進行3次，確定致病菌株。

1.4.4 分子生物學(xué)鑒定 （1）病原菌DNA的提取。按試劑盒說明書提取致病菌株的DNA。

（2）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因的擴增。以菌株DNA為模板，用27F、1492R引物PCR擴增16S rDNA，反應(yīng)體系：3.5 μl模板，2.0 μl引物（10.0 μmol/L），12.5 μl Taq PCR master Mix，7.0 μl ddH2O，總體積25.0 μl。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

用ITS1、ITS4引物PCR擴增rDNA-ITS的反應(yīng)體系：3.5 μl模板，2.0 μl引物（10.0 μmol/L），12.5 μl Taq PCR master mix，7.0 μl ddH2O，總體積為25.0 μl。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物于4 ℃保存，并進行凝膠電泳驗證。

（3）核酸序列的測定。PCR產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行測定。在GenBank中對測得的核酸序列進行BLAST比對分析。

1.4.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 用MEGA 4.0軟件進行核酸序列的聚類分析，用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病株采集

采集藜麥發(fā)病初期、中期、后期3個時期的病株。在發(fā)病初期，病斑直徑約為4 mm（圖1a）;在發(fā)病中期，病斑顏色加深，形狀漸漸不規(guī)則，最大直徑接近1 cm（圖1b）;在發(fā)病后期，病斑顏色較深，部分葉片呈枯萎狀（圖1c）。

2.2 病原菌的分離純化

采集藜麥病株后，用組織分離法[6]進行病原菌的分離，獲得如圖2a至圖2g所示純化菌株。通過肉眼觀察可知，圖2a、圖2f的菌株呈現(xiàn)真菌菌落形態(tài)，圖2b、圖2c、圖2d、圖2e、圖2g的菌株表現(xiàn)為細菌菌落形態(tài)。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定可知，圖2a至圖2g分別為膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）、成團泛菌（Pantoea agglomerans）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、成團泛菌（P. agglomerans）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、裂褶菌（Schizophyllum commune strain）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），分別編號為1、2、3、4、5、6、7。

2.3 致病性鑒定

配制1～7號菌株的菌液并接種健康藜麥葉片。結(jié)果表明，用滅菌水（對照）和編號為1、3、5、6、7的菌株接種10 d后，植株未見病斑發(fā)生（圖3a、圖3b）。由圖3c、圖3d可見，用編號為2、4的菌株處理植株10 d后，均有病斑發(fā)生。由圖3e、圖3f可見，用編號為2、4的菌株接種15 d后，植株患病癥狀明顯加重，病斑擴大并增多，并且病斑顏色加深。用編號為2、4的菌株接種植株后，從感病葉片中分離純化病菌，觀察到與供試菌株相似的形態(tài)特征（圖3g、圖3h），且重復(fù)3次接種試驗的結(jié)果均一致。將分離獲得的2株藜麥葉斑病致病菌分別命名為SCCDP-2、SCCDP-4。

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

將SCCDP-2、SCCDP-4致病菌在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后肉眼觀察菌落的特征，同時通過顯微鏡觀察菌落的形態(tài)特征。由圖4a可見，經(jīng)24 h固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落呈白色，并且表面光滑、邊緣整齊;48 h后，菌落顏色變黃，直徑達到2～3 mm，微凸起于平板，在紫外燈下未出現(xiàn)黃色熒光（圖4b）;顯微鏡（×100）觀察結(jié)果顯示，菌體呈直桿狀，大小為（1.0～2.5） μm×（0.5～1.0） μm，無菌絲結(jié)構(gòu)（圖4c）;革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌落呈陰性，有周生鞭毛（圖4d）。結(jié)合肉眼觀察結(jié)果得出，SCCDP-2、SCCDP-4這2株致病菌的形態(tài)學(xué)特征與細菌一致。

2.5 分子生物學(xué)鑒定

分別提取分離獲得的2株致病菌的DNA，并用引物進行PCR擴增。圖5為PCR擴增得到的電泳圖譜，其中1號、2號條帶對應(yīng)致病菌SCCDP-2的電泳結(jié)果，3號、4號條帶對應(yīng)致病菌SCCDP-4的電泳結(jié)果，可見這2個菌株的16S rDNA擴增產(chǎn)物大小約為1 000 bp。菌株SCCDP-2、SCCDP-4的16S rDNA測序結(jié)果分別見圖6、圖7。將菌株SCCDP-2、SCCDP-4的16S rDNA測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST比對可知，菌株SCCDP-2、SCCDP-4的16S rDNA堿基序列分別與Pantoea agglomerans strain C410P1、Pantoea agglomerans strain NA131的16S rDNA堿基序列有99%、99%的同源性。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹

用MEGA 4.0對致病菌（SCCDP-2、SCCDP-4）的16S rDNA堿基序列進行聚類分析，并用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖8可見，致病菌SCCDP-2和SCCDP-4的16S rDNA堿基序列與泛菌屬（Pantoea）中的成團泛菌（Pantoea agglomerans）處于同一分支，且自展值支持率達到99%以上，提示致病菌SCCDP-2菌株與SCCDP-4菌株的起源相同，是成團泛菌的不同亞型。

3 討論

本研究通過對藜麥葉斑病患病植株進行病菌的分離、培養(yǎng)、純化，共得到7株菌株。依據(jù)科赫法則，用7株菌株的菌液分別浸染健康藜麥植株，篩選得到2株能夠?qū)е罗见溔~斑病的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定這2株菌株為成團泛菌，并且是該菌屬的不同亞型。

目前，國內(nèi)外關(guān)于藜麥相關(guān)病害的系統(tǒng)性研究還比較缺乏，對藜麥葉斑病病因的研究也存在差異。段慧[7]在內(nèi)蒙古種植區(qū)通過研究判斷，導(dǎo)致藜麥葉斑病發(fā)生的病原菌為鏈孢屬（Alternaria）;Testen等[8]在美國發(fā)現(xiàn)的藜麥釘孢葉斑病的致病菌為藜釘孢（Passalora dubia）;殷輝等[9]的研究結(jié)果卻顯示，造成藜麥釘孢葉斑病的病原菌為藜尾孢（Cercospora.cf.chenopodii）。筆者的研究結(jié)果表明，在四川地區(qū)，導(dǎo)致藜麥葉斑病發(fā)生的致病菌為成團泛菌。造成以上差異的原因，可能與不同地域、不同藜麥品種等因素有關(guān)。筆者分離得到的2株細菌菌株能夠感染健康植株，其16S rDNA堿基序列與成團泛菌的同源性達99%以上，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，這2個分離菌株與成團泛菌屬于同一分支，自展值支持率達到99%，提示這2株菌株源于同一祖先，是成團泛菌的不同亞型。成團泛菌作為藜麥葉斑病的致病菌系首次報道。

成團泛菌屬于腸桿菌目腸桿菌科泛菌屬，為泛菌屬的模式種[10]。泛菌屬由成團泛菌（P.agglomerans）和分散泛菌（P.dispersa）2個種組成，是由Beji等[11]和Mergaeri等[12]于1989年提出的新屬。泛屬菌廣泛存在于土壤、水、植物種子表面以及動物和人的傷口、體液中，并可引起病害發(fā)生[13]。據(jù)報道，成團泛菌在植物上可引起稻谷內(nèi)穎褐變[14]以及洋蔥腐爛病[15]、棉花細菌性爛鈴病[16]、香蕉葉鞘腐敗病[10]、玉米稈莖腐病等[13]。由于四川地區(qū)植物種類豐富、種植密度較大，能夠為成團泛菌侵染藜麥提供有利條件;另外，四川盆地氣候濕潤，溫度適宜，也利于成團泛菌的生長。這些原因可能成為四川地區(qū)藜麥葉斑病致病菌為成團泛菌的重要因素。為了提高四川地區(qū)藜麥的種植產(chǎn)量及品質(zhì)，下一步將對成團泛菌的致病機制進行深入探討，同時也將開展四川地區(qū)藜麥葉斑病的生物防治研究。

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（責任編輯：徐 艷）

收稿日期：2020-04-16

作者簡介：廖映凱（1993-），男，四川成都人，碩士研究生，研究方向為雜糧病因?qū)W。（E-mail）631459439@qq.com

通訊作者：邱愛東，（E-mail）quad69@163.com