玉米自交系響應高溫、干旱脅迫的關(guān)鍵基因及通路

姚啟倫　霍仕平　張俊軍

摘要： 以4個不同的玉米自交系為材料，對高溫、干旱處理后的苗期植株進行轉(zhuǎn)錄組測序。玉米自交系響應高溫和干旱脅迫的差異表達基因（DEGs）分別為6 966和6 272個，在高溫和干旱脅迫下4個玉米自交系相同的DEGs分別是705和871個。同時響應高溫和干旱的DEGs有100個。在耐旱、耐熱性強的玉米自交系中鑒定出18個特異的DEGs，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、GT轉(zhuǎn)錄因子和B2熱激轉(zhuǎn)錄因子在脅迫響應中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。KEGG通路分析結(jié)果表明，耐旱、耐熱性強玉米自交響應高溫干旱脅迫的DEGs富集在生物學過程、分子功能、代謝過程、遍在蛋白代謝和氮代謝途徑5條通路。熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的耐旱、耐熱性強于溫帶玉米種質(zhì)，可在熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)中有效篩選耐旱、耐熱基因。

關(guān)鍵詞： 玉米自交系;高溫、干旱脅迫;轉(zhuǎn)錄組;差異表達基因;通路

中圖分類號： S513 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0029-09

Key genes and pathways of maize inbred lines responding to heat and drought stress

YAO Qi-lun1， HUO Shi-ping2， ZHANG Jun-jun3

（1.School of Advanced Agriculture and Bioengineering， Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China;2.Chongqing Three Gorges Acodemy of Agricultural Science， Chongqing 404100， China;3.Heilongjiang Hetian Fengze Agriculture Science and Technology Development Co.， Ltd.， Harbin? 067500， China）

Abstract： Transcriptome sequencing of the four different maize inbred lines subjected to high temperatures and water deficits， was performed at the stage of seedling. In total， 6 966 heat-responsive and 6 272 drought-responsive differentially expressed genes（DEGs） were identified in the four maize lines. In addition， 705 and 871 DEGs were identified as being commonly associated with heat and drought stress， respectively. There were 100 DEGs responding to both heat and drought stress. Eighteen DEGs were identified in maize inbred lines with strong drought tolerance and heat tolerance. The zinc finger transcription factor， WRKY transcription factor， GT transcription factor and B2 heat shock transcription factor played key regulatory roles in stress response. Analyses of KEGG pathway enrichment showed that the pathways such as biological process， molecular function， metabolic process， protein ubiquitination metabolism and nitrogen metabolism were the most highly enriched in the maize lines tolerant to heat and drought. It can be concluded that tropical and subtropical maize is tolerant to heat and drought， implying that it is plausible to screen goal genes in the tropical and subtropical germplasm.

Key words： maize inbred lines;heat and drought stress;transcriptome;differentially expressed genes（DEGs）;pathways

高溫和干旱是抑制玉米生長發(fā)育、制約玉米產(chǎn)量的主要非生物脅迫因子[1]。在干旱、半干旱區(qū)，玉米往往受到高溫干旱復合脅迫的不利影響[2-3]。全球有43 %的干旱、半干旱耕地，中國干旱、半干旱土地面積約占全國土地面積的近50 %[4-5]。隨著溫室效應加劇，預計到本世紀末地表氣溫將上升1～5 ℃，1980-2008年，高溫脅迫導致全球玉米產(chǎn)量下降3.8%[6-7]。因此，篩選玉米耐旱、耐熱基因，培育耐旱、耐熱品種一直是玉米育種界面臨的重大課題。迄今關(guān)于高溫、干旱脅迫對玉米植株形態(tài)、生理生化和產(chǎn)量品質(zhì)不利影響的研究已有較多文獻報道。研究結(jié)果表明，高溫、干旱脅迫下，玉米葉片伸長速率減慢，葉面積減小，莖稈變細[8-9];高溫、干旱會減少玉米葉綠素含量、擾亂光合系統(tǒng)，抑制光合作用[10-12];高溫、干旱會降低ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶及分支酶活性，從而抑制碳水化合物合成[13-14];玉米灌漿期，高溫、干旱打破植株體內(nèi)激素間的平衡，減緩細胞分裂速率，縮小籽粒庫容，導致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[15]。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)在分子水平解析植物對逆境脅迫的響應是生物技術(shù)研究的熱點。通過分析生物細胞中轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律，可在分子水平探究特定生物學過程中基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制[16-17]。玉米在傳播過程中逐漸分化形成了適應其栽培環(huán)境的熱帶、亞熱帶和溫帶種質(zhì)，在分子水平研究不同玉米種質(zhì)的逆境響應機制，可有效指導耐逆玉米基因的發(fā)掘與利用[18]。盡管轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)已成功應用于玉米逆境脅迫研究[19-20]，但在逆境脅迫研究中往往只涉及單個脅迫因子以及單一玉米自交系和雜交種。本研究選取熱帶、亞熱帶和溫帶種質(zhì)，且具有耐旱、耐熱性差異的玉米自交系為供試材料，設(shè)置高溫、干旱2個脅迫處理，結(jié)合高溫、干旱脅迫下不同玉米種質(zhì)的生理特性分析，在轉(zhuǎn)錄組水平分析不同種質(zhì)對高溫、干旱脅迫的分子響應機制，以豐富植物逆境脅迫研究的數(shù)據(jù)資料，并為玉米耐旱、耐熱基因的篩選提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以長江師范學院選育的4個玉米自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16為供試材料，Suwan-3和Suwan-10分別以熱帶和亞熱帶玉米地方品種為基礎(chǔ)材料選育而成， Cim-5和Cim-16以國際玉米小麥改良中心（CIMMYT）的溫帶玉米群體為基礎(chǔ)材料選育而成。2016-2018年田間鑒定玉米自交系的耐旱、耐熱性，參照張麗梅等[21]的方法，分別計算各自交系經(jīng)濟產(chǎn)量的耐旱指數(shù)（DTI）和耐熱指數(shù)（HTI），即干旱（或高溫）脅迫下經(jīng)濟產(chǎn)量與正常條件（CK）下經(jīng)濟產(chǎn)量的比值，根據(jù)經(jīng)濟產(chǎn)量的DTI和HTI篩選出具有明顯耐旱耐熱性差異的熱帶、亞熱帶和溫帶玉米自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16。 熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3、Suwan-10耐旱耐熱性強，經(jīng)濟產(chǎn)量的DTI分別為0.86和0.83，HTI分別為0.91和0.93;溫帶玉米自交系Cim-5和Cim-16耐旱耐熱性弱，經(jīng)濟產(chǎn)量的DTI分別為0.57和0.51，HTI分別為0.55和0.49。Suwan-3和Suwan-10作為耐旱、耐熱性強的玉米自交系（基因型）試驗材料，Cim-5和Cim-16作為耐旱、耐熱性弱的玉米自交系（基因型）試驗材料。

1.2 脅迫處理

高溫、干旱脅迫處理在人工氣候箱中進行，4個玉米自交系種子浸種催芽后在控制條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29 ℃（晝）/23 ℃（夜），相對濕度70%，每天光照12 h。待幼苗生長至5葉1心，4個自交系各種植18株，其中6株作對照、6株作高溫脅迫處理、6株作干旱處理，共72株（每株1個營養(yǎng)缽）。作對照的4株自交系幼苗置于上述人工氣候箱內(nèi)繼續(xù)生長;作高溫處理的4個自交系幼苗在40 ℃（晝）/34 ℃（夜）、相對濕度70%、每天光照12 h的高溫條件下生長7 d;作干旱處理的4個自交系幼苗在溫度29 ℃（晝）/23 ℃（夜）、相對濕度20%、每天光照12 h的控水條件下生長7 d。取每個自交系各個處理3株植株的葉片，葉片剪碎后分成2份分別用作生理指標測定和mRNA轉(zhuǎn)錄組分析。

1.3 生理指標測定

利用便攜式光合儀（LI-6400XT）室外檢測待測植株旗葉的葉綠素熒光參數(shù)值：光反應最大熒光（F′m）、光反應最小熒光（F′o）、暗適應最大熒光（Fm）、暗適應最小熒光（Fo）和穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）;基于F′m、F′o、Fm、Fo和Fs，計算PS II潛在光量子產(chǎn)量（Fv/Fo）、PS II最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、PS II 有效光化學量子產(chǎn)量（ΦPSII）和光化學熒光淬滅系數(shù)（QP） [22-27]。采用李小芳等[28]的方法室內(nèi)檢測葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量、過氧化物酶（POD）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性。數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2010和DPS軟件。

1.4 葉片RNA提取

采用TRIzol（Invitrogen， Carisbad， CA， USA）法提取對照、高溫處理和干旱處理下的4個自交系的葉片RNA，用無RNA的DNA酶Ⅰ去除樣品中的DNA，同時檢測樣品中RNA濃度及其完整性（要求RNA完整值大于6.5），共構(gòu)建12個mRNA文庫。

1.5 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序

經(jīng)片段化后的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，篩選300～500 bp大小的cDNA片段進行PCR擴增，轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies Santa Clata， CA， USA）檢測合格后，在Illumina HiSeq 2500測序平臺（海元莘生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）上進行。測序的基本原理是邊合成邊測序，采用Illumina novaseq 6000測序，雙端測序讀數(shù)150 bp、讀長300 bp。在測序的流式細胞中加入4種熒光標記的 dNTP、DNA 聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的 dNTP 就能釋放出相對應的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得堿基序列信息。

1.6 轉(zhuǎn)錄組序列分析

過濾掉接頭污染、低質(zhì)量（Q<30）和位置堿基氮含量> 5%的初始序列，獲取過濾后序列作后續(xù)分析。過濾后序列比對到玉米B73參考基因組（https：//download.maizegdb.rg/Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0/Zm00001d.2.genomic. fa），利用RSEM（0.9.3版本）軟件作基因表達量估算。以P<0.05和|log2FC|≥1為標準，用edgeR軟件作差異表達基因（DEGs）分析 [29]。在NCBI的玉米基因數(shù)據(jù)庫中獲取DEGs的功能信息，基于內(nèi)部perl腳本在maizeGDB網(wǎng)站上獲取DEGs的GO注釋。

1.7 差異表達基因（DEGs）的定量驗證

以持家基因Actin為標準，選擇8個差異表達基因進行實時定量（qRT-PCR）分析，利用Primer 5.0軟件在線設(shè)計qRT-PCR反應引物（表1），qRT-PCR反應程序按照ABI2100反應體系（Applied Biosystems， CA， USA）的操作要求進行。各個試驗設(shè)置3次重復，采用相對定量（2-△△Ct）法[30]估算基因表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米自交系對高溫、干旱的生理響應

由表2可知，供試材料在單一脅迫因子高溫或干旱條件下，玉米自交系Cim-5和Cim-16 的過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量較對照顯著增加， 4個葉綠素熒光參數(shù)值（Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPS II和QP）較對照顯著下降;熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3和Suwan-10 除丙二醛含量較對照顯著增加外，過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及4個葉綠素熒光參數(shù)值則無顯著變化，這表明在生理上熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的耐旱、耐熱性強于溫帶種質(zhì)。

2.2 玉米自交系響應高溫、干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

由表3可知，測序得到的初始序列經(jīng)過除去接頭污染、低質(zhì)量（Q<30）和位置堿基氮含量> 5%的過濾處理后，4個自交系在對照、高溫和干旱處理條件下的過濾后序列變幅為44 560 000～54 040 000條，其過濾后序列占初始序列的比例在97.5 %以上，說明轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量良好。

在4個玉米自交系轉(zhuǎn)錄組中共檢測到6 966個響應高溫脅迫的差異表達基因，自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16分別有1 444、1 281、2 509和1 732個差異表達基因（圖1A）;在4個玉米自交系轉(zhuǎn)錄組中共檢測到6 272個響應干旱脅迫的DEGs，自交系Suwan-3、Suwan-10、Cim-5和Cim-16分別有1 843、1 841、1 414和1 174 個差異表達基因（圖1B）;4個玉米自交系在高溫、干旱和高溫干旱脅迫下相同的DEGs分別是705、871和100個， 分別占差異表達基因總數(shù)的42%、52%和6%（圖1C）?？傮w上，溫帶玉米自交系響應高溫、干旱脅迫的差異表達基因數(shù)（6 829）高于熱帶、亞熱帶玉米自交系（6 409）。這表明在分子水平，高溫、干旱脅迫對溫帶玉米自交系的影響更大。

2.3 熱帶、亞熱帶玉米自交系在高溫、干旱脅迫下特異的差異表達基因

為探明玉米自交系中的耐旱、耐熱關(guān)鍵基因，用在FPKM（1 000 000條序列中單個基因的數(shù)目）中比對上的Reads數(shù)目來度量基因表達水平，在P<0.05和|log2FC|≥1標準下，在耐旱、耐熱性強的熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3和Suwan-10 中篩選特異的差異表達基因。由表4可知，在耐旱、耐熱性強的玉米自交系Suwan-3和Suwan-10中有18個特異的差異表達基因同時響應高溫和干旱脅迫。這18個差異表達基因極顯著差異表達，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、GT轉(zhuǎn)錄因子和B2熱激轉(zhuǎn)錄因子一致上調(diào)，這4個轉(zhuǎn)錄因子在玉米響應高溫、干旱脅迫中可能發(fā)揮關(guān)鍵的遺傳調(diào)控作用。

采用qRT-PCR技術(shù)，選擇8個響應高溫、干旱的關(guān)鍵基因Zm00001d053913、Zm00001d018803、Zm00001d035139、Zm00001d002801、Zm00001d012325、Zm00001d015743、Zm00001d017597和 Zm00001d020614，驗證轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因的表達結(jié)果，盡管基因Zm00001d012325、Zm00001d015743、Zm00001d017597和 Zm00001d020614在轉(zhuǎn)錄組測序中差異表達不顯著，但這4個基因在植物響應高溫、干旱中發(fā)揮重要作用。由圖2可見，基因Zm00001d053913、Zm00001d002801、Zm00001d015743和Zm00001d017597上調(diào)表達，而基因Zm00001d018803、Zm00001d035139、Zm00001d012325和 Zm00001d020614下調(diào)表達，實時定量試驗數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（RNA-Seq prolifing）結(jié)果一致?；騔m00001d035139 （編碼MA3結(jié)構(gòu)域蛋白）在轉(zhuǎn)錄組測序中上調(diào)表達，而在差異表達基因的定量驗證中下調(diào)表達，這可能是在基因的定量驗證中以持家基因Actin作參照的結(jié)果。

2.4 玉米自交系差異表達基因的GO注釋

通過對差異表達基因的GO（Gene Ontology）分析，可確定與差異表達基因相關(guān)的基因本體項（GO terms），追溯差異表達基因的GO分類條目，揭示差異表達基因與其功能調(diào)節(jié)關(guān)系。根據(jù)Kim等[29]的方法，顯示4個玉米自交系差異表達基因的GO分類注釋結(jié)果，由圖3中的A2 Vs A1和B2 Vs B1可見，熱帶、亞熱帶玉米自交系Suwan-3和Suwan-10響應高溫脅迫的差異表達基因在腺嘌呤核苷結(jié)合、腺嘌呤脫氧核苷結(jié)合、脫氧核苷結(jié)合、核苷結(jié)合、細胞大分子代謝、細胞內(nèi)細胞器部分（Intracellur organelle part）、細胞器部分（Organelle part）、初級代謝過程、分子功能、催化活性、大分子代謝途徑和生物學過程12個基因本體項同時上調(diào)（A2 Vs A1和B2 Vs B1）;響應干旱脅迫的差異表達基因在生物學過程、大分子代謝途徑、分子功能、代謝途徑、質(zhì)膜、脅迫響應、蛋白質(zhì)代謝途徑以及堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝途徑8個基因本體項共富集（A3 Vs A1和B3 Vs B1）;熱帶、亞熱帶和溫帶玉米自交系響應高溫、干旱脅迫的差異表達基因僅在分子功能和生物學過程2個基因本體項同時上調(diào)，這表明高溫、干旱脅迫主要影響玉米分子功能和生物學過程。

2.5 熱帶、亞熱帶玉米自交系差異表達基因的KEGG通路

KEGG通路分析結(jié)果（圖4）表明，高溫、干旱脅迫下自交系Suwan-3和Suwan-10有30個通路受到調(diào)控，涉及16個生物學途徑、9個細胞組分和5個生物學功能通路，生物學過程、分子功能、代謝過程、遍在蛋白和氮代謝途徑5條通路上有大量差異表達基因富集。顯著性檢驗閥值（P值）顯示，大量極顯著的差異表達基因富集在分子功能、代謝過程、遍在蛋白代謝、氮代謝途徑和生物學調(diào)節(jié)通路。由此推測這些通路在玉米響應高溫、干旱脅迫中發(fā)揮主要作用。

3 討論

3.1 不同玉米種質(zhì)響應高溫、干旱脅迫的關(guān)鍵基因

生產(chǎn)上高溫往往伴隨干旱，不同基因型的玉米種質(zhì)存在耐旱、耐熱性差異[4，7]。本研究轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，高溫、干旱脅迫下不同種質(zhì)來源的4個玉米基因型存在大量差異表達基因，4個玉米基因型均有100個相同的同時響應高溫和干旱脅迫的差異表達基因，在耐旱、耐熱性強的玉米自交系中有18個特異的差異表達基因，由此推測這18個差異表達基因調(diào)節(jié)玉米對高溫、干旱脅迫的適應性。植物對高溫、干旱脅迫的分子響應是一個包括眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控網(wǎng)絡[31]。熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）在玉米響應高溫、干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，植物中的HSFs包括A、B和C 3類，除響應高溫脅迫外，HSFs還參與其他逆境脅迫的響應[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫、干旱脅迫下，一個B類HSFs在耐旱、耐熱性強的玉米自交系中顯著上調(diào)。GT轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子和鋅指轉(zhuǎn)錄因子也是玉米響應非生物脅迫的主要調(diào)控因子[33]。這3個轉(zhuǎn)錄因子同樣存在于本研究18個特異的差異表達基因編碼中。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，除轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，還有一些基因參與玉米響應高溫、干旱脅迫，這些基因編碼重要的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，其中Zm00001d035139和Zm00001d035475基因分別編碼MA3結(jié)構(gòu)域蛋白和異戊烯輔酶A脫氫酶。

3.2 不同玉米種質(zhì)響應高溫、干旱脅迫的通路

通路分析是脅迫生物學中常用的方法。通路即代謝途徑，通過調(diào)控植物體內(nèi)物質(zhì)合成、生理活性和光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運，進而響應逆境脅迫[34]。生物學過程、代謝過程和生物學調(diào)節(jié)是植物體內(nèi)重要的代謝通路，參與能量物質(zhì)和生理活性物質(zhì)的合成與運輸[35]。Zenda等[36]研究發(fā)現(xiàn)，耐旱玉米自交系在干旱脅迫下生物學過程、代謝過程和生物學調(diào)節(jié)通路上的差異表達基因高度富集，這與本研究KEGG通路分析結(jié)果一致。氮代謝途徑是植物生長發(fā)育過程中的一條主要的生理代謝通路，直接參與植物細胞成分合成與細胞活性調(diào)節(jié)[33]。氮代謝途徑是旱生植物響應干旱脅迫的關(guān)鍵通路，遍在蛋白作為調(diào)控因子參與植物逆境脅迫響應，在高溫、干旱等逆境脅迫下遍在蛋白代謝通路上的差異表達基因高度富集[37]。本研究KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐旱、耐熱性強的玉米基因型在高溫、干旱脅迫下，氮代謝和遍在蛋白代謝通路上的差異表達基因顯著富集。

綜上，在高溫、干旱脅迫下，不同玉米種質(zhì)耐旱、耐熱基因通過差異表達調(diào)控其代謝通路，從而顯現(xiàn)生理上的耐旱、耐熱性差異，使玉米耐旱、耐熱基因的篩選成為可能?；谇捌谔镩g鑒定及本研究結(jié)果，熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)耐旱、耐熱性強于溫帶玉米種質(zhì)，在熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)中篩選耐旱、耐熱基因更有效。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-03-17

基金項目：國家自然科學基金項目（31371633）;重慶市教委優(yōu)秀成果轉(zhuǎn)化項目（KJZH17133）

作者簡介：姚啟倫（1964-），男，重慶萬州人，博士，教授，主要從事玉米遺傳育種研究。（Tel）13908253365;（E-mail）yql641@aliyun.com