中藥川貝母產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃與DNA分子鑒別研究進(jìn)展

羅 舜，章文偉，羅 敏，鄧才富，鄒艷，楊永東，李品明

(重慶市藥物種植研究所，重慶 南川 408435)

中藥川貝母(FritillariaecirrhosaeBulbus)為百合科貝母屬多年生植物，分別是川貝母FritillariacirrhosaD. Don、暗紫貝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia、甘肅貝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂貝母F.delavayiFranch.、太白貝母F.taipaiensisP. Y. Li和瓦布貝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis(S. Y. Tang et S. C. Yue) Z. D. Liu,S. Wang et S. C. Chen六種[1]。中藥川貝母為鱗莖入藥，主用于痰熱咳嗽、咯痰帶血、瘰疬瘡瘍腫毒[2]。現(xiàn)代藥理研究表明其具有鎮(zhèn)咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用[3]。中藥川貝母因其需求量大、生境特殊且種子休眠期長(zhǎng)、自然萌發(fā)率低、野生資源過(guò)度采挖等原因被收載到《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》中[4-5]。一些地區(qū)引種馴化中藥川貝母成功率不高，原因在于引種品種與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境不適宜[6]。因此，開展中藥川貝母產(chǎn)地生態(tài)適宜性研究來(lái)增加藥材資源供給就顯得十分迫切[7-8]。中藥材的基原決定臨床用藥的真?zhèn)蝃9]，市場(chǎng)上流通的不合格的中藥川貝母中往往摻雜有浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母等偽品[10-11]。對(duì)不同來(lái)源的種植材料、中藥材進(jìn)行鑒定分析就顯得十分重要，而分子鑒別技術(shù)具有不受外界環(huán)境差異和生物體發(fā)育階段及器官組織差異等影響的優(yōu)點(diǎn)[12]。本文從中藥川貝母6種基原植物的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)情況、基于地理信息系統(tǒng)(GIS)對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃及其DNA分子鑒別技術(shù)(PCR-RFLP、DNA條形碼技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR)等方面給以綜述，為保證中藥川貝母的不同基原品種在生態(tài)適宜的區(qū)域種植出質(zhì)優(yōu)的中藥材研究提供參考。

1 中藥川貝母的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)情況

表1 中藥川貝母6種基原植物在全國(guó)范圍內(nèi)傳統(tǒng)的產(chǎn)區(qū)情況Table1 Traditional production areas of six basic plants of F. cirrhosae Bulbus in China

2 中藥川貝母產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃分析技術(shù)

2.1 中藥材產(chǎn)地適宜性分析地理信息系統(tǒng)及其升

級(jí)系統(tǒng)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所以GIS為分析平臺(tái)，評(píng)價(jià)藥材道地產(chǎn)區(qū)氣候、土壤和海拔等生態(tài)地理因子與全國(guó)其他地區(qū)的相似性差異，根據(jù)相似程度等級(jí)來(lái)確定藥材的適宜產(chǎn)地，為藥材引種成功開發(fā)了《中藥材產(chǎn)地適宜性分析地理信息系統(tǒng)》(Traditional Chinese medicine geographic information system，TCMGIS-I)[17-18]。王瑀等人[19]應(yīng)用該系統(tǒng)分析了中藥川貝母基原植物之一的暗紫貝母在全國(guó)的產(chǎn)地適宜性區(qū)劃，得到一部分與若爾蓋生態(tài)氣候條件相似的可以發(fā)展暗紫貝母生產(chǎn)的新的可能區(qū)域。劉輝等人[8]將該系統(tǒng)應(yīng)用于川貝母的產(chǎn)地適宜性研究，也得到一些未見文獻(xiàn)報(bào)道的川貝母適宜產(chǎn)區(qū)，比如新疆的拜城縣、烏魯木齊市等11個(gè)縣市。段寶忠等人[20]采用升級(jí)系統(tǒng)《中藥材產(chǎn)地適宜性分析地理信息系統(tǒng)》(TCMGIS-Ⅱ)分析了太白貝母在全國(guó)的產(chǎn)地適宜性區(qū)劃。結(jié)果表明，全國(guó)適宜主產(chǎn)區(qū)面積大小按省份排名依次為四川、甘肅、陜西，居第四位的云南省為新的適宜區(qū)域。張婕等人[21]采用更新為全球的4大數(shù)據(jù)庫(kù)(基礎(chǔ)地理信息數(shù)據(jù)庫(kù)、氣候因子數(shù)據(jù)庫(kù)、土壤數(shù)據(jù)庫(kù)和藥用植物分布空間數(shù)據(jù)庫(kù))后的藥用植物全球產(chǎn)地生態(tài)適宜性分析信息系統(tǒng)(Geographic information system for global medicinal plants，GMPGIS)[22]研究了中藥川貝母6種基原植物川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母在全球的生態(tài)適宜性區(qū)劃。結(jié)果表明，中國(guó)和美國(guó)所占區(qū)域超過(guò)全球最適栽培區(qū)面積的2/3以上，中國(guó)為57%，美國(guó)為29%，哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦等我國(guó)相鄰國(guó)家亦有少量最適栽培區(qū)域。

2.2 遙感技術(shù)

方清茂等人[23]在GIS軟件的支持下，從川產(chǎn)道地藥材生長(zhǎng)生態(tài)因子空間數(shù)據(jù)中提取適宜暗紫貝母生長(zhǎng)要求的高程、年平均氣溫和年降水量，然后將獲得的高程、年均溫和年降水3圖層依次疊加到通過(guò)分析遙感影像得到的四川省土地利用現(xiàn)狀圖中，最后進(jìn)行空間分析。結(jié)果顯示，暗紫貝母的最適宜區(qū)主要為四川青藏高原東南緣的亞寒帶干燥氣候區(qū)，如阿壩藏族自治州若爾蓋、紅原、松潘、九寨溝、茂縣、黑水、理縣、馬爾康等地。

2.3 最大墑情模型(Maxent模型)

Maxent模型應(yīng)用在物種分布數(shù)據(jù)不全的情況下，可以得到關(guān)于物種潛在分布區(qū)的滿意結(jié)果[24]。劉艷梅等人[25]首先用Maxent模型選取對(duì)暗紫貝母的分布貢獻(xiàn)率較大的主要生態(tài)因子，然后將Maxent生成的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GIS系統(tǒng)中，得出暗紫貝母在全國(guó)的潛在分布適生區(qū)，結(jié)果表明四川阿壩藏族羌族自治州、青海省果洛藏族自治州和甘肅省甘南藏族自治州是暗紫貝母最適宜的潛在種植區(qū)。王娟娟等人[26]采用GIS結(jié)合Maxent模型的方法，對(duì)川貝母進(jìn)行了產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃，結(jié)果得出川貝母在我國(guó)的最適宜區(qū)面積由大到小依次是四川、西藏、云南、甘肅和貴州等地。趙文龍等人[6]對(duì)中藥川貝母的4個(gè)基原植物川貝母、甘肅貝母、梭砂貝母和暗紫貝母的適宜區(qū)也按同樣的方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，川貝母最適宜區(qū)主要分布在四川中西部、云南北部及西藏東部；甘肅貝母最適宜區(qū)主要分布在甘肅甘南地區(qū)與青海交界處、四川西部地區(qū)；梭砂貝母最適宜區(qū)主要集中在川藏交界處的大部分山區(qū)；暗紫貝母最適宜區(qū)主要集中在甘肅甘南、四川阿壩和青海果洛的部分地區(qū)。蔣舜媛等人[4]按相同的方法對(duì)中藥川貝母的5個(gè)基原植物太白貝母、梭砂貝母、甘肅貝母、川貝母、暗紫貝母進(jìn)行了適宜性區(qū)劃，得到中藥川貝母的生長(zhǎng)適宜性空間分布數(shù)據(jù)之后，還將其和與中藥川貝母化學(xué)指標(biāo)成分總生物堿相關(guān)的品質(zhì)適宜性空間分布數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，最后再結(jié)合土地利用等環(huán)境因素進(jìn)行綜合分析，形成了對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有指導(dǎo)意義的中藥川貝母功能型生產(chǎn)區(qū)劃。研究結(jié)果表明，中藥川貝母功能型生產(chǎn)區(qū)劃主要分布在四川、甘肅、青海、西藏、云南和陜西這6個(gè)省的適宜性區(qū)縣。

3 中藥川貝母的DNA分子鑒別技術(shù)

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

(PCR-RFLP)技術(shù)

PCR-RFLP是一種利用PCR擴(kuò)增目的DNA片段，再使用特異性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物切割成不同大小片段，最后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù),因僅有正品DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物被酶切，我們即可依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖中真?zhèn)纹繁憩F(xiàn)出的不同特征條帶鑒別真?zhèn)蝃27-28]。

《中華人民共和國(guó)藥典》2010版第一增補(bǔ)本中收錄了基于ITS序列的中藥川貝母PCR-RFLP鑒別法[28]。張文娟等人[28]用該方法成功鑒別了太白貝母和太白貝母的偽品(伊貝母)，并進(jìn)一步用基于ITS2的DNA條形碼方法驗(yàn)證了PCR-RFLP法的準(zhǔn)確性。張文娟等人[10]還將川貝母藥材DNA與伊貝母藥材DNA按不同比例混合后，應(yīng)用PCR-RFLP法進(jìn)行混合樣品中偽品的檢出限度試驗(yàn)，結(jié)果顯示伊貝母藥材摻入比例低至0.5%時(shí)仍可被PCR-RFLP法檢出。周亭亭和孫麗媛科研團(tuán)隊(duì)[29-30]開發(fā)了與PCR-RFLP法鑒定圖譜一致的試劑盒法，該方法提取核酸的純度和濃度更好，他們又用此試劑盒法對(duì)全國(guó)的70份樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b定，檢測(cè)出川貝母?jìng)纹?3份，正品川貝母37份，體現(xiàn)出良好的檢測(cè)效果。胡偉等人[31]運(yùn)用PCR-RFLP法對(duì)市售中藥川貝母部分樣品進(jìn)行鑒別時(shí)，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增階段還產(chǎn)生了除310 bp的目的條帶外小于250 bp的未知條帶，接著在NCBI進(jìn)行BLAST序列同源性比對(duì)分析后，確認(rèn)未知條帶是中藥材中常見真菌的ITS1條帶，將下游引物重新設(shè)計(jì)在中藥川貝母與真菌序列差異較大的ITS2區(qū)域，并用改進(jìn)后的PCR-RFLP方法重新鑒定樣品，結(jié)果顯示出其準(zhǔn)確性優(yōu)于中國(guó)藥典2015年版中給出的方法。張文娟等人[32]近年運(yùn)用PCR-RFLP法鑒定暗紫貝母與其偽品時(shí)，偽品也在100～250 bp出現(xiàn)2條酶切條帶，他們還搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST鑒定暗紫貝母?jìng)纹?，未鑒定出其屬于哪個(gè)貝母植物。

3.2 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)是一種利用公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA片段進(jìn)行物種鑒別的技術(shù)，即在所有正品物種中找到相同的一段DNA片段進(jìn)行測(cè)序，作為標(biāo)準(zhǔn)序列保存在數(shù)據(jù)庫(kù)中用來(lái)鑒別物種正偽[33-34]。DNA條形碼技術(shù)主要操作流程包括：提取樣品的DNA、引物PCR擴(kuò)增候選片段、測(cè)序并分析序列等[35]。其常用分析方法有最近遺傳距離法、BLAST及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析等[36]。2015版《中國(guó)藥典》收錄的DNA 條形碼技術(shù)指導(dǎo)原則指出植物類藥材應(yīng)以核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2序列為主，葉綠體DNA psbA-trnH序列為輔；而動(dòng)物類藥材以線粒體DNA COⅠ序列為主，ITS2序列為輔[35]。

羅焜等人[37]應(yīng)用ITS2序列差異實(shí)現(xiàn)了5種經(jīng)常使用的混偽品(伊犁貝母、平貝母、米貝母、一輪貝母、土貝母)與川貝母的鑒別。鄭輝等人[38]在PCR-RFLP法鑒別川貝母及其近緣種的基礎(chǔ)上，還擴(kuò)增樣品的ITS2和psbA-trnH條形碼序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明兩種技術(shù)均實(shí)現(xiàn)了川貝母與其遺傳距離較遠(yuǎn)物種(包括平貝母、浙貝母及伊犁貝母)的鑒別，但都未實(shí)現(xiàn)川貝母6種基原植物之間以及它們與其它偽品(包括康定貝母、濃蜜貝母、中華貝母、長(zhǎng)腺貝母)之間的鑒別。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針或熒光染料，通過(guò)伴隨整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生的熒光信號(hào)累積來(lái)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[39]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括TaqMan探針?lè)ê蚐YBR Green I法兩種方法[40]。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度或組成不同，其熔解曲線(熔解溫度)也存在差異，因此可根據(jù)熔解曲線的差異進(jìn)行物種的鑒別[41]。

羅達(dá)龍等人[42]采用磁珠法提取中藥川貝母中特有DNA片段的同時(shí)，按同樣的方法對(duì)平貝母、浙貝母、土貝母進(jìn)行處理后，進(jìn)行SYBR Green I法試驗(yàn)。結(jié)果提示，除中藥川貝母在PCR時(shí)存在拷貝外，平貝母、浙貝母、土貝母無(wú)拷貝現(xiàn)象，該結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可用于中藥川貝母及其混偽品的鑒別。潘杰等人[43]將實(shí)時(shí)熒光定量PCR(探針?lè)?結(jié)合溶解曲線的方法應(yīng)用到中藥川貝母與伊貝母的鑒別試驗(yàn)中，分析它們各自的PCR產(chǎn)物形成的熔解曲線時(shí)，發(fā)現(xiàn)中藥川貝母的熔解溫度Tm為(71.765±0.625)℃，伊貝母Tm為(64.685±0.055)℃。據(jù)此可知中藥川貝母與伊貝母的Tm具有特異性，進(jìn)而就實(shí)現(xiàn)了鑒別中藥川貝母和伊貝母的目的。陳慕媛等人[44]還用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green I法)結(jié)合溶解曲線鑒別中藥川貝母與常見偽品平貝母、湖北貝母、新疆貝母、浙貝母,結(jié)果提示中藥川貝母熔解曲線呈尖銳峰形且Tm為80.98℃，與常見偽品平貝母、湖北貝母、新疆貝母、浙貝母對(duì)照藥材的熔解曲線溫度和峰形有明顯差異，據(jù)此可知該法也可運(yùn)用于中藥川貝母及其常見偽品的鑒別。

4 結(jié)語(yǔ)

該研究基于地理信息系統(tǒng)對(duì)中藥川貝母的產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃研究的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，分別應(yīng)用TCMGIS系統(tǒng)、GMPGIS系統(tǒng)、遙感技術(shù)和最大墑情模型這些現(xiàn)代技術(shù)到中藥川貝母產(chǎn)地生態(tài)適宜性的研究中，得到了適宜推廣川貝母種植的新區(qū)域，相較于傳統(tǒng)靠專家的經(jīng)驗(yàn)更加高效[21]。蔣舜媛等人[4]在利用最大墑情模型進(jìn)行川貝母產(chǎn)地生態(tài)適宜性研究的同時(shí)，還采用地統(tǒng)學(xué)的協(xié)同克里金空間插值法將川貝母品質(zhì)與產(chǎn)地關(guān)聯(lián)起來(lái)開展研究，這樣劃分出來(lái)新的適宜種植區(qū)域更具有科學(xué)性。后來(lái)的研究者在推廣其它中藥材品種種植時(shí)，可以借用此方法進(jìn)行深入研究。

PCR-RFLP、DNA條形碼技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR都能成功鑒別川貝母與其常見偽品(如伊貝母、浙貝母、平貝母)。鄭輝等人[38]的研究表明，PCR-RFLP、ITS2加psbA-trnH條形碼組合技術(shù)都未能實(shí)現(xiàn)川貝母6種基原植物之間以及它們與其它偽品(康定貝母、濃蜜貝母、中華貝母、長(zhǎng)腺貝母)之間的鑒別。

目前，為解決此類近緣種之間無(wú)法鑒別的難題，一部分研究者建議應(yīng)建立以DNA分子鑒定為主，傳統(tǒng)的形狀鑒定、化學(xué)鑒別為輔的鑒定體系[45]，比如，國(guó)產(chǎn)黑果枸杞和巴西中草藥蒲公英在流通環(huán)節(jié)都存在使用偽品，顧選等人[46-47]采用類似的研究方法(DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)分析相結(jié)合的方法)，成功區(qū)分開真?zhèn)纹?。另一些研究者建議把葉綠體的基因組作為超級(jí)條形碼來(lái)鑒別物種[48],葉綠體基因組的大小可達(dá)到110～160 kb,較DNA片段具有更多的遺傳信息。研究者們借助葉綠體基因組之差異分別實(shí)現(xiàn)了豆蔻屬物種(32種)、橐吾屬物種(6種)和石斛屬物種(41種)的鑒別[49]。還有一部分研究者提議從葉綠體基因組中篩選高變異區(qū)域[49],李瀅等人[50]在貝母屬4種植物(川貝母、湖北貝母、太白貝母和瓦布貝母)的葉綠體全基因組中開展了相關(guān)研究，結(jié)果顯示在葉綠體基因區(qū)域未篩選到可鑒定貝母屬物種的特異性DNA條形碼，而篩選到的7個(gè)葉綠體基因間區(qū)可作為貝母屬特異性DNA條形碼的候選片段。同時(shí)，以上3種方法的快速實(shí)現(xiàn)都建立在人們上傳更多的生物DNA序列到基因數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中。