漢坦病毒感染致血小板減少的機(jī)制

王曉艷，杜 虹，李 璟，姜 泓，申煥君，王平忠

漢坦病毒是一個“屬”的名稱，歸布尼亞病毒科。該“屬”病毒包括引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）的漢灘病毒（hantaanvirus,HTNV）、漢城病毒、普馬拉病毒、多布拉伐病毒、泰國病毒，引起漢坦病毒心肺綜合征的辛諾柏病毒、紐約病毒、安第斯病毒，以及與人類關(guān)系尚不清楚的一組病毒，如希望山病毒、圖拉病毒等。其中，HTNV和漢城病毒分別是我國姬鼠型（Ⅰ型）和家鼠型（Ⅱ型）疫區(qū)引起HFRS的主要流行毒株。HFRS流行于歐亞大陸，而漢坦病毒肺綜合征流行于北美洲和南美洲。全球每年約有6萬～10萬HFRS患者，90%以上分布在中國，病死率可達(dá)5%～10%[1]。盡管國內(nèi)外學(xué)者對漢坦病毒及其相關(guān)疾病的研究已取得了重要進(jìn)展，但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，也無特效治療藥物。漢坦病毒主要感染人血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起毛細(xì)血管廣泛損傷，通透性增加。臨床上HFRS主要表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓休克、出血和腎功能衰竭。毛細(xì)血管通透性增加是上述臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)，與HFRS患者出現(xiàn)嚴(yán)重血小板減少密切相關(guān)。近年，雖然漢坦病毒感染致血小板減少的機(jī)制尚不完全明確，但也取得了一些重要進(jìn)展。

1 血小板的生成及調(diào)控

血小板由多能造血干細(xì)胞（pluripotential hematopoietic stem cell,PHSC）定向分化而成。從PHSC形成血小板主要經(jīng)歷了以下階段：PHSC定向分化為巨核細(xì)胞（megakaryocyte,MK）、MK增殖成熟、前血小板形成和血小板釋放。在此過程中，細(xì)胞表面標(biāo)志物和核內(nèi)染色體均發(fā)生了顯著變化。CD61（整合素β3）、CD41（整合素αIIb）和CD42（GPIb復(fù)合體）是MK分化的標(biāo)志物。CD41和CD61構(gòu)成異二聚體的受體復(fù)合體GPIIb/IIIa（αIIbβ3整合素）存在于MK譜系細(xì)胞（從MK祖細(xì)胞到血小板）的表面。CD41表達(dá)水平隨細(xì)胞的成熟而增加，而CD42（GPIb復(fù)合體：GPIbα、GPIbβ、GPⅨ和GPⅤ）表達(dá)稍晚于CD41，它對應(yīng)晚期分化階段。當(dāng)啟動血小板蛋白合成后，CD34消失。與此同時，MK前體通過核內(nèi)有絲分裂增加染色體倍數(shù)。MK成熟后，具有偽足的前血小板斷裂脫落生成血小板。

MK分化和血小板釋放過程受特異性轉(zhuǎn)錄因子NF-E2和GATA-1的調(diào)控。NF-E2是由造血特異性亞基（p45）和廣泛表達(dá)的亞基（p18）構(gòu)成的異二聚體。NF-E2在MK成熟、前血小板形成和血小板釋放以及建立血小板正常功能中起非常重要的作用[2]。目前，已鑒定的NF-E2靶基因主要有：β微管蛋白（表達(dá)于MK分化的晚期，是形成前血小板所需微管的主要成分）、Rab27b（一種小的G蛋白，與血小板顆粒運(yùn)輸有關(guān)，在前血小板形成中起重要作用）、半胱天冬酶-12（高表達(dá)于成熟的MK，但在血小板中無表達(dá)）和凝血烷合成酶（該酶可促進(jìn)血小板凝集）[3]。GATA-1是GATA家族成員之一。GATA-1高表達(dá)于紅細(xì)胞、MK和肥大細(xì)胞。GATA-1缺陷表現(xiàn)為明顯的血小板減少和嚴(yán)重貧血[4]。依賴GATA-1表達(dá)的基因主要是紅系和MK譜系的特異性基因，包括紅細(xì)胞生成素受體、α/β球蛋白、c-mpl[血小板生成素（thermoplastic polyolefin,TPO）的受體]、血小板糖蛋白 [Ibα、Ibβ、IIb（αIIb）、IX、VI]和血小板因子-4（PF-4/CXCL-4）等[5]。可見，NF-E2和GATA-1通過調(diào)控血小板生成過程所必需的蛋白，調(diào)節(jié)血小板的形成。

此外，血小板生成過程還受一些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、IFN-α和CXC趨化因子（如IL-8、IP-10、PF-4、β-TG等）是MK生成的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，其中最重要的是TGF-β1。TGF-β1通過自分泌或旁分泌機(jī)制在造血系統(tǒng)的多個階段均發(fā)揮多效調(diào)節(jié)作用[6]。TPO（也稱MK生長和發(fā)育因子）、IL-3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干細(xì)胞因子可促進(jìn)MK增殖，TPO、IL-6、IL-11和白血病抑制因子能促進(jìn)MK多倍體化和細(xì)胞質(zhì)成熟。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，增殖誘導(dǎo)配體APRIL（屬于TNF超家族的細(xì)胞因子）也是MK生長和分化過程關(guān)鍵的因子，其受抑制可減少成熟MK數(shù)量[7]。

由此可見，轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子在血小板生成調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子是處于“中心”地位的“內(nèi)源”因素，通過調(diào)控血小板生成過程中所必需的蛋白，直接影響血小板的形成，而細(xì)胞因子則是一種“外源”因素，為血小板形成提供必需的“微環(huán)境”，在生理?xiàng)l件下，二者協(xié)同以保證血小板的正常生成，并維持其正常數(shù)量。但在疾病條件下（如病毒感染、藥物治療等），可能抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或細(xì)胞核移位，或者使細(xì)胞因子表達(dá)異常（如促進(jìn)血小板生成的因子下降，而抑制血小板生成的因子上升），最終影響干細(xì)胞分化和MK成熟，導(dǎo)致血小板生成障礙，引起血小板減少。

2 病毒感染致血小板減少的機(jī)制

多種病毒感染均可致血小板減少，其機(jī)制包括“中心機(jī)制”和“外周機(jī)制”（圖1）。

圖1 病毒感染致血小板減少的機(jī)制（根據(jù)文獻(xiàn)總結(jié)）Figure 1 Mechanism of thrombocytopenia induced by viral infection (based on literature)

2.1 中心機(jī)制 血小板生成過程的任一環(huán)節(jié)異常，均可致血小板數(shù)量減少。HIV-1 gp120 V3環(huán)序列可抑制CD34+祖細(xì)胞向MK譜系的特異性分化，對MK生成的抑制可能通過c-mpl的表達(dá)減少及其隨后的信號傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物-5活化下降而實(shí)現(xiàn)[8]。人皰疹病毒-6感染CD34+細(xì)胞可抑制集落形成單位MK的形成[9]。人巨細(xì)胞病毒感染CD34+造血干細(xì)胞，可抑制集落形成單位MK的增殖和分化[10]，人巨細(xì)胞病毒感染MK系（CHRF-288-11），可誘導(dǎo)凋亡，致血小板減少[11]。

病毒性出血熱是由沙粒病毒科、布尼亞病毒科、纖絲病毒科和黃病毒科的病毒引起的一種急性全身性發(fā)熱綜合征。引起病毒性出血熱的病原體雖有不同，但其標(biāo)志特征都是血管滲漏、血小板減少、凝血功能不全和出血[12]。Junin病毒（Junin virus,JUNV）是沙粒病毒科的成員，感染可引起阿根廷出血熱。用JUNV感染TPO體外誘導(dǎo)的臍血CD34+細(xì)胞。結(jié)果表明，JUNV感染不影響CD34+細(xì)胞的增殖、存活和定向分化，但可降低前血小板形成和血小板釋放。其原因主要是JUNV感染引起轉(zhuǎn)錄因子NF-E2的表達(dá)水平下降，而GATA-1的表達(dá)水平基本沒有變化[13]。登革病毒（dengue virus,DV）屬黃病毒科成員，感染可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征。在骨髓中，DV抑制MK的發(fā)育是其誘導(dǎo)血小板減少的關(guān)鍵機(jī)制[14-15]。

因此，病毒感染可能調(diào)控造血干細(xì)胞分化、MK增殖成熟、前血小板形成和血小板釋放，最終影響血小板生成。

2.2 外周機(jī)制 除上述“生成障礙”（中心機(jī)制）外，“外周破壞”（外周機(jī)制）也是一個重要因素。這些外周機(jī)制主要包括：血小板抗體介導(dǎo)的活化和清除、血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用、血小板功能異常、病毒感染血小板和彌漫性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation,DIC）。在DV感染者中，上述外周機(jī)制的一些因素參與了血小板減少癥的發(fā)生[16]。HCV感染可引起不同程度的血小板減少。研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重血小板減少組（＜100 000/μl），骨髓抑制和自身免疫（血小板抗體）破壞共存。在中等程度血小板減少組（100 000～125 000/μl），26.9% 的患者僅有骨髓抑制，11.5%的患者僅有自身免疫破壞，61.5%的患者兩種機(jī)制共存。在輕度血小板減少組（126 000～149 000/μl），其機(jī)制主要是自身免疫破壞[17]。HBV、HCV相關(guān)性肝硬化患者，血漿TPO水平下降，血小板更新加快，血小板產(chǎn)生減少[18]，表明該類患者血小板減少是一個多因素結(jié)果，既有血小板清除增加的因素，也有血小板生成減少的因素。

由此可見，不同病毒引起血小板減少的機(jī)制可能有別。在正常生理?xiàng)l件下，血小板數(shù)量處于恒定水平，但在疾病條件下（如病毒感染、藥物治療等），可能引起血小板生成減少和/或外周破壞增加，最終導(dǎo)致血小板數(shù)量減少。血小板減少癥患者出血的風(fēng)險隨著血小板數(shù)量和功能的下降而增加。因此，了解病毒感染致血小板減少的機(jī)制，對臨床治療策略和發(fā)病機(jī)制研究及藥物設(shè)計具有重要的指導(dǎo)意義。

3 漢坦病毒感染致血小板減少的機(jī)制

盡管許多病毒感染可致血小板減少，但漢坦病毒感染引起的急性血小板減少具有更明顯的臨床表現(xiàn)和更嚴(yán)重的后果（如出血、低血壓休克、腎功能衰竭等）。對漢坦病毒心肺綜合征患者的研究發(fā)現(xiàn)，輕型患者入院時血小板計數(shù)越低越易進(jìn)展至重型[19]。臨床上，HFRS患者在低血壓休克期，血小板數(shù)量急劇減少，直至少尿期血小板仍處于較低水平，并出現(xiàn)嚴(yán)重的血管滲漏，是HFRS患者的主要死因之一[20]。出血的風(fēng)險隨著血小板數(shù)量減少和功能的下降而增加，表明HFRS患者出現(xiàn)的血管滲漏與病程中血小板減少有密切的關(guān)系。

漢坦病毒感染致血小板減少的機(jī)制尚不完全清楚，但近年也取得了一些重要進(jìn)展。血小板由造血干細(xì)胞分化形成的MK產(chǎn)生，在維持血小板數(shù)量平衡中起至關(guān)重要的作用。HFRS患者病程中出現(xiàn)的嚴(yán)重“血小板減少”，不僅與“外周破壞增加”有關(guān)，而且還可能與“血小板生成障礙”有關(guān)。

目前關(guān)于外周破壞機(jī)制的研究包括：①αIIbβ3整合素[即血小板糖蛋白IIb/IIIa，其中β3亞基（CD61）是致病漢坦病毒的主要受體，也是MK分化的早期標(biāo)志]是血小板表面最豐富的受體，在血小板活化、聚集和粘附中起重要作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，HTNV和HTNV感染的內(nèi)皮細(xì)胞均可結(jié)合靜止的血小板，阻止其活化[22]，提示HTNV感染不僅減少了血液中游離血小板的有效濃度，而且還可能導(dǎo)致血小板功能異常。②HFRS患者血小板CD61表達(dá)水平明顯高于健康對照，其表達(dá)越高，血小板減少癥的發(fā)生率就越高。同時，CD61表達(dá)水平在少尿期與血小板數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[23]，提示漢坦病毒感染可上調(diào)CD61表達(dá)，其結(jié)果是增加了病毒感染，但影響了血小板的數(shù)量。③普馬拉病毒感染可引起流行性腎病 （流行于歐洲的一種輕型HFRS），研究發(fā)現(xiàn)在急性流行性腎病病程中，血小板減少與自然抗凝血降低、凝血酶時間縮短及纖維蛋白溶解增加有關(guān)[24]，提示DIC參與了血小板減少癥的發(fā)生，因DIC須消耗大量血小板。④在HFRS患者和流行性腎病患者中發(fā)現(xiàn)，血小板糖蛋白Ia、IIb/IIIa具有多態(tài)性，這種多態(tài)性可能改變了分子構(gòu)象，導(dǎo)致血小板功能異常，引起血小板減少[25-26]。

MK生成是血小板形成過程最重要的階段。與“血小板生成障礙”相關(guān)的研究包括：用HTNV感染MK系（HEL）和人原代MK（CD34+細(xì)胞經(jīng)TPO體外誘導(dǎo)5 d產(chǎn)生于培養(yǎng)液中的較大細(xì)胞）可上調(diào)β3整合素（CD61）表達(dá)，而CD42（MK生成的晚期標(biāo)志）表達(dá)沒有變化[27]，提示HTNV感染可能抑制MK的成熟。本課題組用HTNV感染MK系（HEL）12 h、24 h、36 h，RT-PCR檢測NF-E2、GATA-1和c-mpl mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染36 h后，與未感染組相比，NF-E2和GATA-1表達(dá)水平均有下降，而c-mpl表達(dá)水平基本沒有變化（結(jié)果待發(fā)表），提示HTNV感染可能抑制MK轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而減少血小板的產(chǎn)生。其次，用ELISA測定了HFRS患者不同病期TPO和TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)從發(fā)熱期到恢復(fù)期TPO含量雖有下降，但無明顯差異，其受體（c-mpl）的表達(dá)也無明顯變化。而低血壓休克期TGF-β1含量顯著高于其他各病期，TGF-β1含量越高，血小板數(shù)量越少（結(jié)果待發(fā)表），提示TGF-β1是血小板生成負(fù)向調(diào)控的主要因子，在HFRS患者血小板減少的形成中可能起重要作用?？梢姡瑵h坦病毒感染引起的血小板減少，“中心機(jī)制”和“外周機(jī)制”可能都參與其中，最終導(dǎo)致血小板減少。

4 展 望

盡管血小板減少是漢坦病毒相關(guān)疾病的重要特征，但漢坦病毒感染致血小板減少的機(jī)制迄今尚不完全清楚。血小板減少可由生成障礙和/或外周破壞引起。前者因血小板生成“受阻”所致（中心機(jī)制），后者主要包括免疫介導(dǎo)的血小板活化和清除、血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用、血小板功能異常、DIC和病毒感染血小板（外周機(jī)制）等。近年，關(guān)于漢坦病毒感染致血小板減少的報道，大都集中在外周機(jī)制方面，而對于中心機(jī)制的研究很少。未來系統(tǒng)闡明漢坦病毒感染致血小板減少的原因，將為發(fā)病機(jī)理和治療策略研究及藥物設(shè)計提供重要的科學(xué)依據(jù)。