AFB1通過ROS-Caspase通路誘導(dǎo)的奶牛肝細胞凋亡

賈紅豆

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生物技術(shù)中心，黑龍江 大慶 163319）

黃曲霉毒素是由生長在食品中的真菌（例如黃曲霉和寄生曲霉）作為次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生劇毒的化合物。黃曲霉毒素的主要關(guān)注點在于它們的致癌特性，這一點已通過大量動物實驗和一些流行病學(xué)研究證明，黃曲霉毒素的暴露與肝癌發(fā)病率的增加有關(guān)。此外，肉、奶、蛋和其他動物來源產(chǎn)品中的黃曲霉毒素殘留可能對人體健康造成額外危害。黃曲霉毒素B1（AFB1）污染的飼料喂養(yǎng)母牛的牛奶中檢測出黃曲霉毒素M1（AFM1）的殘留。此外，在牛的肌肉組織和雞蛋中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素的殘留[1]。在已知18種黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2被國際癌癥研究機構(gòu)視為A類致癌物。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌作用最為嚴重[2]。它需要氧化8，9-乙烯基鍵以產(chǎn)生具有生物活性的AFB1-8，9-環(huán)氧化合物，該化合物可以與DNA，RNA和蛋白質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致組織細胞損傷。

奶牛養(yǎng)殖中使用的許多飼料成分（棉籽、花生、玉米、大豆、大米、干魚、蝦和魚粉）被認為是AFB1污染的主要來源。由于近年來飼料中霉菌毒素污染的問題日益嚴重，因此嚴重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。肝臟是動物機體主要的毒物代謝器官。AFB1進入肝臟后可以導(dǎo)致肝細胞氧化應(yīng)激、凋亡損傷，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生。而AFB1對奶牛的毒性損傷報道較少。因此，本實驗通過采用不同濃度的AFB1處理奶牛肝細胞，研究AFB1對奶牛肝細胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響，為防治AFB1對奶牛毒性損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 奶牛肝細胞的分離、培養(yǎng)和處理

收集犢牛肝臟，以分離原代肝細胞。通過兩步灌注法分離肝細胞[3]。無菌采集犢牛肝臟，將肝臟組織采用含有膠原酶的灌流液進行消化，隨后剪碎肝臟。依次使用100目（150 μM）和200目（75 μM）的細胞篩過濾肝細胞。在RPMI-1640基本培養(yǎng)基中清洗2次后，將肝細胞懸液在4℃下以500×g離心5 min。將分離的肝細胞接種到6孔板中，并在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。隨后將分離和培養(yǎng)的奶牛肝細胞使用DMSO（對照組）及1、2和4 μM AFB1處理12 h。

1.2 ROS含量檢測

用DCFH-DA染色測定法測量細胞內(nèi)ROS濃度。將細胞與25 μM DCFH-DA孵育20 min，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，并重懸于PBS中，通過流式細胞儀測量細胞內(nèi)ROS的含量。

1.3 SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量檢測

使用南京建城生物技術(shù)研究所（中國南京）的分光光度診斷試劑盒測定細胞中SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量。收集細胞并將其懸浮在PBS中，在560 nm（SOD），420 nm（GSH-Px）和532 nm（MDA）處檢測吸光度，并使用722N分光光度計（上海科學(xué)儀器有限公司）記錄吸光度。

1.4 蛋白提取和Western-blot實驗

使用蛋白質(zhì)提取試劑盒從肝細胞中分離總蛋白質(zhì)，使用BCA方法檢測蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE分離，并將其轉(zhuǎn)移到0.45 m的PVDF膜上。在室溫下，將膜用3%BSA Tris緩沖鹽水/Tween緩沖液封閉4 h，然后與Caspase3和Caspase9抗體在4℃過夜。將膜洗滌3次，并與相應(yīng)二抗在室溫下孵育45 min。用ECL化學(xué)發(fā)光溶液檢測蛋白條帶。

1.5 凋亡率檢測

收集細胞并用PBS洗滌2次，使用Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。根據(jù)說明書步驟進行操作，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用平均值±標準差的表示。采用oneway ANOVA法進行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05表示差異顯著。P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 AFB1對ROS和MDA含量的影響

為了研究檢測AFB1是否可以誘導(dǎo)奶牛肝細胞氧化應(yīng)激，本實驗采用不同濃度AFB1處理奶牛肝細胞。結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞中ROS和MDA的含量顯著升高。隨著AFB1濃度升高，ROS和MDA的含量逐漸增加。說明AFB1可以誘導(dǎo)奶牛肝細胞氧化應(yīng)激。

圖1 ROS和MDA含量

2.2 AFB1對SOD和GSH-Px活性的影響

結(jié)果表明，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞中SOD和GSH-Px活性顯著降低（見圖2）。隨著AFB1濃度升高，SOD和GSH-Px活性逐漸下降。說明AFB1可以降低奶牛肝細胞抗氧化能力。

圖2 SOD和GSH-Px活性

2.3 AFB1對Caspase3和Caspase9蛋白表達的影響

結(jié)果表明，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞中Caspase3和Caspase9蛋白表達量顯著升高（見圖3）。隨著AFB1濃度升高，Caspase3和Caspase9蛋白表達量逐漸增加。說明AFB1可以激活奶牛肝細胞Caspase凋亡通路。

圖3 AFB1對Caspase3和Caspase9蛋白表達的影響

2.4 AFB1對奶牛肝細胞凋亡的影響

結(jié)果表明，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞凋亡率顯著升高（見圖4）。隨著AFB1濃度升高，凋亡率逐漸增加。說明AFB1可以誘導(dǎo)奶牛肝細胞凋亡。

圖4 AFB1對奶牛肝細胞凋亡的影響

3 討論

AFB1是毒性最高的黃曲霉毒素之一。研究發(fā)現(xiàn)AFB1對動物具有肝毒性，遺傳毒性和免疫毒性作用[4]。由于AFB1存在于奶牛飼料中，且對奶牛具有肝毒性和免疫毒性，可以導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低，奶中AFB1殘留從而降低奶牛的生產(chǎn)性能。肝臟被認為是人類和動物中執(zhí)行許多重要功能的最重要器官，同時也充當(dāng)毒素的主要器官。大多數(shù)黃曲霉毒素（包括AFB1）在肝臟中以8，9-環(huán)氧形式結(jié)合DNA和蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)細胞凋亡，從而破壞肝臟的形態(tài)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1可以增加奶牛肝細胞中ROS和MDA的含量，降低肝細胞抗氧化能力，并激活Caspase凋亡通路，最終導(dǎo)致奶牛肝細胞凋亡。

氧化應(yīng)激被認為是AFB1誘導(dǎo)肝毒性的關(guān)鍵因素。活性氧（ROS）的過度形成，細胞抗氧化能力降低會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。在正常的細胞代謝過程中，線粒體產(chǎn)生ROS，包括氧離子，自由基和脂質(zhì)氫過氧化物等[6]。然而，在沒有抗氧化劑機制來抵消這些分子的過量產(chǎn)生的情況下，氧化應(yīng)激可直接增加蛋白質(zhì)和DNA的損傷并誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，如，丙二醛（MDA）[7]，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細胞和組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)AFB1可以導(dǎo)致豚鼠肝臟DNA和脂質(zhì)損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1可以增加奶牛肝細胞中ROS和MDA的含量，且ROS和MDA的含量隨著AFB1濃度增加而升高。這些研究說明AFB1可以導(dǎo)致奶牛肝細胞氧化損傷。SOD和GSH-Px是清除ROS的主要功能酶。本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1可以降低奶牛肝細胞中SOD和GSH-Px的活性，且SOD和GSH-Px的活性隨著AFB1濃度增加而降低。這些研究說明AFB1可以損害奶牛肝細胞抗氧化能力。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞損傷的重要原因之一是導(dǎo)致細胞凋亡[9]。過量ROS的產(chǎn)生引起線粒體功能障礙，進而激活線粒體凋亡途徑。Caspase信號通知在控制線粒體凋亡途徑中起著關(guān)鍵作用。過量的ROS可激活Caspase9，活化的Caspase9裂解下游的caspase，如Caspase3，從而啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1可以增加奶牛肝細胞中Caspase3和Caspase9蛋白表達量及細胞凋亡率，且Caspase3和Caspase9蛋白表達量及細胞凋亡率隨著AFB1濃度增加而升高。這些研究說明AFB1可以激活ROS-Caspase凋亡通路，誘導(dǎo)奶牛肝細胞凋亡。

綜上所述，本試驗研究表明AFB1可以導(dǎo)致奶牛肝細胞氧化應(yīng)激，隨后激活Caspase凋亡通路，繼而誘導(dǎo)奶牛肝細胞凋亡。