線粒體移植在心肌缺血再灌注損傷中的作用

陳迪 程德琴 劉曉紅 徐志云

急性心肌梗死多由冠狀動(dòng)脈閉塞引起，目前主要通過藥物、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)以及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)等恢復(fù)血流供應(yīng)的手段治療急性心肌梗死。心肌缺血再灌注損傷是指由于各種原因?qū)е滦募∪毖獡p傷，在恢復(fù)血流供應(yīng)后再次引起心肌損傷[1]。線粒體在維持心肌持續(xù)收縮和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[2]。在心肌缺血再灌注損傷中，引起心肌細(xì)胞損傷的生物化學(xué)改變主要起源于線粒體功能障礙[3]。線粒體功能障礙導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)合成減少，活性氧(ROS)生成增加[4-5]。ATP合成減少導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙[6]，過量的ROS引起心肌細(xì)胞損傷和凋亡[7]，最終引起心力衰竭[8-9]。

對(duì)線粒體功能障礙發(fā)生機(jī)制中的某個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)可以使心功能得到明顯改善，這提示線粒體替換是心臟保護(hù)的重要途徑[10]。線粒體移植是指從健康細(xì)胞或組織中分離出功能完好的線粒體替代受損的線粒體，減輕因線粒體功能障礙導(dǎo)致的心肌損傷，為心臟提供充足的能量，維持心臟穩(wěn)態(tài)[11]。

1 線粒體移植產(chǎn)生心肌保護(hù)的機(jī)制

移植的線粒體具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的心肌保護(hù)作用。超聲心動(dòng)圖和壓力容積測(cè)量實(shí)驗(yàn)顯示，線粒體進(jìn)入心臟10 min后即可改善心功能[12]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，在線粒體移植后，心肌細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)物和細(xì)胞呼吸前體代謝物增加，心肌細(xì)胞活力增強(qiáng)[12-13]。移植后10 min至1 h，線粒體通過肌動(dòng)蛋白依賴的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)移至心肌細(xì)胞中[14]。進(jìn)入心肌細(xì)胞后，移植的線粒體可進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞ATP水平并上調(diào)心肌保護(hù)性細(xì)胞因子[12]。后者通過刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移[15]及促進(jìn)血管形成，減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心功能恢復(fù)[16]，改善心肌重構(gòu)，此過程不依賴于心肌細(xì)胞再生。研究發(fā)現(xiàn)移植后的線粒體可完整取代受損的線粒體從而挽救心肌細(xì)胞[17]。

研究表明，移植的線粒體可使心肌細(xì)胞的活力和功能至少維持28 d，線粒體移植后未發(fā)生心律失常，未發(fā)生自身免疫反應(yīng)[12,18]，炎性細(xì)胞因子水平也未明顯提高[19]。

2 線粒體的內(nèi)化、來源和移植方法

細(xì)胞中的線粒體可以從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中[20]。關(guān)于線粒體的內(nèi)化機(jī)制有多種假說，如肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[14]、巨胞飲作用[21]等。采用針對(duì)這些機(jī)制的特異性抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抑制肌動(dòng)蛋白聚合的特異性抑制劑降低了線粒體內(nèi)化，表明直接注射的線粒體可能通過肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)移至心肌細(xì)胞內(nèi)[14]。

線粒體的來源主要有心室肌[22]、骨骼肌[12]、腹直肌[23]、胸大肌[11]和腓腸肌[24]。研究發(fā)現(xiàn)，移植間充質(zhì)干細(xì)胞來源的線粒體可成為治療組織損傷的新策略[25]。同等質(zhì)量的不同組織提供的線粒體數(shù)量不同，肝臟提供的最多，其次是骨骼肌，再次是心肌。從不同組織分離的線粒體在被細(xì)胞攝取的方式和對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用上沒有顯著差異[13,17]。線粒體移植對(duì)心臟的保護(hù)作用高度依賴于完整的、功能完好的線粒體[17]，未存活的線粒體、線粒體組分(蛋白質(zhì)、復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ)、線粒體DNA和RNA、外源性ATP均不具有細(xì)胞保護(hù)作用[21]。Preble等[26]以標(biāo)準(zhǔn)化的商用組織分離器代替手動(dòng)操作，使用差異過濾代替差異離心法，可在30 min內(nèi)快速分離和高度純化線粒體，獲得完整的、功能完好的線粒體。

線粒體移植的方法目前有共培養(yǎng)法[27]、小肽標(biāo)記法[28]、離心轉(zhuǎn)移法[29]、微注射法[30]、直接注射法[22-23]和經(jīng)血管輸注法[18,24]等。其中，直接注射法和經(jīng)冠狀動(dòng)脈輸注法是研究線粒體移植對(duì)心臟保護(hù)作用的主要方法，兩者均可以將大量的游離線粒體一次性輸注到目的區(qū)域，顯著提高移植效率。在早期研究中，從正常家兔左心室中分離出功能完好的線粒體，通過注射器直接注射到離體心臟缺血區(qū)，發(fā)現(xiàn)移植了健康線粒體的缺血心臟ATP水平增加，心肌細(xì)胞活力和心肌收縮功能顯著增強(qiáng)[12,22]。此外，線粒體可以通過冠狀動(dòng)脈輸注，與直接注射相比，經(jīng)冠狀動(dòng)脈輸注的線粒體在整個(gè)心肌中的分布更為迅速和廣泛，目標(biāo)區(qū)域的線粒體濃度更高，在10 min內(nèi)就可提供心臟保護(hù)作用，明顯增加了線粒體移植的臨床治療潛力[18]。

3 線粒體移植的心肌保護(hù)作用

3.1 線粒體移植在動(dòng)物模型中的心肌保護(hù)作用

Mccully等[22]于2009年在離體灌注的兔缺血心臟中首次進(jìn)行線粒體移植實(shí)驗(yàn)，該研究從兔心室肌中分離出濃度為(7.7±1.5)×106/mL的線粒體，直接注射到心臟局部缺血30 min的部位，發(fā)現(xiàn)血清肌酸激酶同工酶和心肌肌鈣蛋白Ⅰ顯著降低，提示線粒體移植可使心肌損傷減輕。同時(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)線粒體移植后心肌細(xì)胞的ATP水平增加，心肌細(xì)胞凋亡減少，心肌梗死面積縮小，提示心肌缺血后線粒體移植具有顯著的心肌保護(hù)作用。

在另一項(xiàng)對(duì)兔缺血再灌注心臟進(jìn)行線粒體移植的研究中，研究人員從兔骨骼肌中分離出濃度為(9.7±1.7)×106/mL的線粒體，分別向8個(gè)心肌缺血區(qū)直接注射，24 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)線粒體進(jìn)入心肌細(xì)胞周圍的間隙。線粒體移植4周后，心肌細(xì)胞凋亡減少，心肌梗死面積沒有增加，超聲心動(dòng)圖顯示線粒體移植后心臟舒張壓和收縮壓均恢復(fù)至正常水平，提示線粒體移植增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的功能，減少了心肌細(xì)胞的凋亡和壞死[12]。在對(duì)豬缺血再灌注心臟進(jìn)行線粒體移植的實(shí)驗(yàn)研究中，從豬胸大肌中分離出濃度為(9.93±1.43)×107/mL的線粒體，分別向8個(gè)心肌缺血區(qū)直接注射。注射4周后，在心臟中檢測(cè)到移植的線粒體，線粒體移植后未發(fā)生明顯的心肌超微結(jié)構(gòu)的異常改變[11]。

在心臟移植缺血再灌注損傷小鼠模型中，供體心臟在切除后和移植到受體5 min后，均經(jīng)冠狀動(dòng)脈注入0.5 mL含1×108個(gè)線粒體的緩沖液。接受線粒體移植后，小鼠移植后心臟的左室射血分?jǐn)?shù)和左室縮短率明顯增加，心肌細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，提示線粒體移植緩解了心臟移植后發(fā)生的缺血再灌注損傷，為心臟移植后心功能改善提供了新的治療方式[24]。另一研究在缺血再灌注發(fā)生2 h后進(jìn)行線粒體移植，結(jié)果顯示線粒體移植同樣減少了心肌梗死面積，使局部和整體心肌功能增強(qiáng)[31]。

3.2 線粒體移植在人體中的心肌保護(hù)作用

2017年美國(guó)波士頓兒童醫(yī)院首次在5例患兒中開展臨床試驗(yàn)，其中4例患兒因冠狀動(dòng)脈梗阻、1例因左室擴(kuò)張伴心內(nèi)膜下缺血而出現(xiàn)心肌功能障礙，且均無法脫離體外膜氧合(ECMO)支持。該研究在20～30 min內(nèi)從患兒腹直肌提取功能完好的線粒體，在超聲心動(dòng)圖定位下直接注射到10余個(gè)心肌缺血部位，每個(gè)部位注射線粒體懸液50～100 μL，每名患兒接受約1×109個(gè)線粒體。線粒體移植后，患兒未發(fā)生與線粒體注射有關(guān)的不良反應(yīng)，如心律失常、心肌內(nèi)血腫或疤痕，所有患兒的心肌收縮功能均有明顯改善。線粒體移植后第2天，除1例患兒因腎衰竭并發(fā)癥發(fā)生多器官衰竭，其余患兒均成功脫離ECMO支持。超聲心動(dòng)圖顯示，治療前患兒均有中至重度心臟收縮功能障礙伴局部運(yùn)動(dòng)功能減退，線粒體移植4～6 d后，患兒心功能均有改善。線粒體移植10 d后，患兒心臟收縮功能均恢復(fù)正常，無局部運(yùn)動(dòng)障礙[23]。

4 小結(jié)與展望

線粒體移植有望成為治療心臟缺血再灌注損傷的新技術(shù)。線粒體移植對(duì)缺血再灌注損傷的心肌有保護(hù)作用。線粒體內(nèi)化機(jī)制和移植的適宜劑量目前尚不明確。線粒體移植在心臟缺血再灌注損傷保護(hù)領(lǐng)域中開展的臨床試驗(yàn)有限，樣本量少，還需要進(jìn)一步研究其長(zhǎng)期安全性和有效性。隨著對(duì)線粒體移植的深入研究，有望研發(fā)出具備高特異性、無免疫排斥性的線粒體生物制劑。