熒光 PCR探針熔解曲線法檢測(cè)老年肺結(jié)核患者耐藥性的價(jià)值

王智慧 董雅坤 池躍朋 邸紅芹 梁亞充 謝蘭品

隨著人口老齡化，老年肺結(jié)核及耐藥患者的逐年增加已成為全世界結(jié)核病流行的普遍現(xiàn)象，若不能及時(shí)確診，極易誤診誤治，嚴(yán)重影響老年結(jié)核病患者的治療轉(zhuǎn)歸。因此，對(duì)老年耐藥肺結(jié)核患者的早期診斷和治療十分重要。筆者應(yīng)用熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)老年肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌(MTB)臨床分離株對(duì)一線抗結(jié)核藥品的耐藥性，以評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)老年耐藥肺結(jié)核患者的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性搜集2018年9月至2020年10月河北省胸科醫(yī)院收治的159例年齡≥65歲的老年肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，所有患者肺結(jié)核診斷明確[1]，具有影像學(xué)檢查陽(yáng)性體征、BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)鑒別培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)初步菌種鑒定為MTB，且臨床資料充分。其中，男101例(63.52%)，女58例(36.48%)；年齡范圍65～90歲，平均年齡(70.8±5.6)歲。

二、研究方法

1.試劑和儀器：BACTEC MGIT 960快速全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感性檢測(cè)系統(tǒng)和BACTEC MGIT 960液體藥物敏感性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；EctractorTM34快速核酸提取儀(北京博奧生物集團(tuán)有限公司)；MTB耐藥突變檢測(cè)試劑盒(包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、MTB核酸提取試劑均購(gòu)自廈門致善生物科技股份有限公司；Bio-Rad CFX96 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2.痰標(biāo)本前處理及分離培養(yǎng)：取患者0.5 ml 經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH消化液處理過(guò)的痰液樣本重懸液加至含MTB添加劑的液體培養(yǎng)管中，混勻后放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中，儀器報(bào)陽(yáng)后取培養(yǎng)液進(jìn)行初步菌種鑒定。

3.初步菌種鑒定(PNB生長(zhǎng)試驗(yàn))：取1～2 ml分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)液加入至無(wú)菌試管中，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，?.5%吐溫-80生理鹽水逐步稀釋至10-2mg/ml菌懸液，分別取0.1 ml接種于PNB培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基(對(duì)照)各1支，最終接種菌量為10-3mg，37 ℃孵育，每周觀察1次結(jié)果并記錄培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況，直至孵育4周?？焖偕L(zhǎng)的非結(jié)核分枝桿菌于1周左右可見菌落；緩慢生長(zhǎng)的分枝桿菌需4周報(bào)告結(jié)果。MTB復(fù)合群在 PNB培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。對(duì)鑒定為MTB的臨床分離株進(jìn)行后續(xù)的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)。

4.藥敏試驗(yàn)：對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性的MTB菌液采用BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，藥物濃度分別為：1、2、4、8 μg/ml，0.2、0.4、0.8、1.6 μg/ml，2.5、5、10、20 μg/ml，1、2、4、8 μg/ml。

5.熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)：待測(cè)樣品加入等量4%NaOH溶液進(jìn)行液化，按照說(shuō)明書制備核酸提取液。將2 μl提取好的核酸加入擴(kuò)增反應(yīng)液，放入熒光定量PCR儀擴(kuò)增。取FAM通道的循環(huán)閾值(Ct值)<30的核酸提取物進(jìn)行熒光PCR探針熔解曲線法耐藥檢測(cè)。分別將異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥檢測(cè)試劑盒平衡至室溫、熔解，加入5 μl核酸提取物及PCR混合液和酶混合液，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照為含有相應(yīng)野生型擴(kuò)增靶基因的質(zhì)粒。反應(yīng)檢測(cè)程序參照說(shuō)明書。待測(cè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照之間的熔解曲線熔點(diǎn)差值(Tm)≤1 ℃為野生型，≥2 ℃則為突変，介于1 ℃～2 ℃間則為耐藥性不明確。如果同時(shí)檢出突變峰和野生峰，則報(bào)告為異質(zhì)性耐藥。

6.耐藥基因測(cè)序：對(duì)熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)和BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致的樣本送至華大基因科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序篩選分析。從利福平的rpoB基因507～533共27個(gè)氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，利福平耐藥決定區(qū))的突變進(jìn)行篩選；從異煙肼ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30 及-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))及katG315密碼子的突變進(jìn)行篩選；從乙胺丁醇embB基因的耐藥決定區(qū)內(nèi)是否含有突變進(jìn)行篩選；從鏈霉素rpsL基因43位密碼子和88位密碼子及rrs基因513～517位點(diǎn)和905～908位點(diǎn)是否含有突變進(jìn)行篩選。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，分析熒光PCR探針熔解曲線法的敏感度、特異度、符合率；兩種方法的一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75為兩者一致性較好，0.4≤Kappa值<0.75為兩者一致性一般，Kappa值<0.4為兩者一致性較差。

結(jié) 果

一、 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

159株臨床分離株中，藥敏試驗(yàn)檢測(cè)97株(61.01%)敏感，62株(38.99%)耐藥；其中，耐利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素菌株分別為59株(37.11%)、61株(38.36%)、40株(25.16%)、43株(27.04%)。

二、 熒光PCR 探針熔解曲線法耐藥檢測(cè)效能

以BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR 探針熔解曲線法對(duì)4種一線抗結(jié)核藥品耐藥性的檢測(cè)效能較好，見表1。

三、基因測(cè)序情況

兩種檢測(cè)方法檢測(cè)MTB臨床分離株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥性不一致的菌株分別有4、6、27、31株。其中，熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)為耐藥的菌株分別有3、4、22、23株，且經(jīng)耐藥基因測(cè)序均發(fā)現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn)，見表2。

討 論

我國(guó)是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，同時(shí)也是人口老齡化大國(guó)。因老年患者多伴有呼吸及循環(huán)系統(tǒng)等基礎(chǔ)疾病，常會(huì)掩蓋肺結(jié)核引起的咳嗽、發(fā)熱、氣短等癥狀；加之老年患者治療依從性差、臟器功能衰退、抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)和不規(guī)范抗結(jié)核治療多見[2]，常多次反復(fù)治療，產(chǎn)生耐藥[3-4],成為我國(guó)結(jié)核病傳播的重要防治難點(diǎn)。又因?yàn)槟退幗Y(jié)核病治療成本高、周期長(zhǎng)、治愈率低、死亡率高，早期診斷老年耐藥結(jié)核病對(duì)其早期制定合理化療方案、提高治療成功率、降低死亡率、減少耐藥MTB傳播有積極意義。

表1 熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線抗結(jié)核藥品耐藥性的效能

表2 不同藥品經(jīng)兩種耐藥性檢測(cè)方法結(jié)果不一致MTB菌株的耐藥基因測(cè)序結(jié)果

目前，MTB及其耐藥性快速檢測(cè)技術(shù)包括BACTEC MGIT 960快速分枝桿菌培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、GeneXpert MTB/RIF等。傳統(tǒng)BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)耗時(shí)需21～28 d，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥，導(dǎo)致延誤治療；基因芯片法則操作繁瑣，且需PCR后處理，存在擴(kuò)增產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)，并只能檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥，檢測(cè)位點(diǎn)相對(duì)少；GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)MTB及其利福平耐藥性簡(jiǎn)便快速的自動(dòng)化檢測(cè)，但不能檢測(cè)利福平以外抗結(jié)核藥品的耐藥情況，對(duì)臨床指導(dǎo)意義有限，且需要專門儀器，價(jià)格也較昂貴。本研究采用的熒光PCR 探針熔解曲線法是第三代PCR技術(shù)閉管檢測(cè)，是將擴(kuò)增和檢測(cè)兩步驟合一，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)擴(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)，僅需6～7 h就可準(zhǔn)確檢測(cè)出MTB對(duì)多種藥品的耐藥性情況，可有效指導(dǎo)臨床用藥，縮短診斷時(shí)間[5-6]。

本研究結(jié)果顯示，熒光PCR 探針熔解曲線法對(duì)一線抗結(jié)核藥品耐藥性的檢測(cè)效能及與BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性均較好，與嚴(yán)虹等[7]和胡春梅等[8]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)兩種檢測(cè)方法不一致的臨床分離株進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)為耐藥、熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)為敏感的菌株，均未檢測(cè)到基因突變；而在BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)為敏感、熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)為耐藥的菌株中，發(fā)現(xiàn)其均存在rpob513、531位點(diǎn)，katG315密碼子和inhA-15C啟動(dòng)子區(qū)，embB306、406位點(diǎn)，rrs514、517位點(diǎn)和rpsL43、88位點(diǎn)突變?？赡茉蛴校?1)BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果雖然是當(dāng)前檢測(cè)MTB耐藥的常用標(biāo)準(zhǔn)，但其結(jié)果判讀中灰區(qū)的存在會(huì)影響結(jié)果判讀；(2)乙胺丁醇和鏈霉素耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致的菌株較多，可能與MTB對(duì)這兩種藥品耐藥不穩(wěn)定，易發(fā)生動(dòng)態(tài)變化有關(guān)[9]；(3)熒光PCR 探針熔解曲線法只是篩選核酸序列而不是氨基酸序列，可能會(huì)將那些不引起氨基酸改變的突變(沉默突變)判定為突變型；(4)檢測(cè)樣品中可能含有雜合耐藥菌株，需要結(jié)合熔解曲線峰型才能判斷突變比例。若雜合耐藥株中耐藥菌的比例低于40%時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致熔解峰與陽(yáng)性對(duì)照一致，而將試驗(yàn)菌株判定為對(duì)藥品敏感，造成假陰性結(jié)果；(5)基因測(cè)序方法僅能測(cè)定已知的耐藥基因，對(duì)其他基因或基因區(qū)引起的突變以及其他耐藥機(jī)制引起的耐藥則不能測(cè)定出來(lái)。

綜上，熒光PCR 探針熔解曲線法檢測(cè)老年肺結(jié)核患者對(duì)一線抗結(jié)核藥品的耐藥性結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測(cè)結(jié)果一致性較好，且檢測(cè)快速、敏感度高、特異度強(qiáng)，可早期指導(dǎo)臨床用藥及后期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。值得注意的是本次研究樣本量較少，且基因突變位點(diǎn)檢測(cè)均在已知位點(diǎn)中篩選，故研究結(jié)果存在一定局限性。