miR-223-3p 和MMP-9 聯(lián)合檢測(cè)在川崎病冠狀動(dòng)脈病變?cè)缙谠\斷中的臨床價(jià)值

王 麗,趙洋洋,高 燕,高吊清,賈旭林,劉 菲,楊蕊華,陰懷清

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種急性、發(fā)熱性血管炎疾病,最常見(jiàn)于5 歲以下的兒童,它能夠影響多個(gè)系統(tǒng),尤其心血管系統(tǒng),是小兒獲得性心臟病的主要原因,并增加了成年后心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)[1]。KD 主要影響中小血管,易侵犯冠狀動(dòng)脈,如果不能早期診斷并予以治療,則25%的病人可能會(huì)發(fā)展為冠狀動(dòng)脈病變,如冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈瘤、冠狀動(dòng)脈狹窄甚至猝死[2-3]。基于KD 可能引起對(duì)冠狀動(dòng)脈的損害作用,因此,尋找可靠生物標(biāo)志物早期發(fā)現(xiàn)KD 冠狀動(dòng)脈損傷,并及時(shí)予以治療,以改善病人預(yù)后具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA 具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能,在許多生物學(xué)過(guò)程和疾病(包括KD)中起關(guān)鍵作用,其中miR-223-3p 可能與KD 患兒血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)[4]。近年來(lái),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的酶,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)[5-6]。過(guò)度表達(dá)和激活MMPs 可誘導(dǎo)組織破壞,在多種疾病中起重要作用,包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牙周疾病、癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化[5-7]。MMP-9 是 MMP 家族中的重要成員之一,MMP-9 可能與炎癥性血管病變發(fā)生有關(guān),并且可能參與了KD 患兒冠狀動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的過(guò)程,從而引起了臨床對(duì)KD血管損害的重視[8]。本研究檢測(cè)KD患兒血清miR-223-3p 和MMP-9 的表達(dá)水平,為早期發(fā)現(xiàn)KD 合并冠狀動(dòng)脈病變及病情評(píng)估提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 KD 組:選取2018 年8 月—2019 年8月于山西省兒童醫(yī)院小兒心血管內(nèi)科收治的KD 患兒80 例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合日本KD 研究委員會(huì)第四次修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9],為急性期的患兒。排除1 周內(nèi)應(yīng)用過(guò)丙種球蛋白(IVIG)及除外出現(xiàn)IVIG 不良反應(yīng)等狀況的患兒,排除其他急性發(fā)熱出疹性疾病、先天性心臟及血管疾病等,發(fā)病年齡為2 個(gè)月至7 歲;男58例,女22 例。根據(jù)心臟彩超顯示的冠狀動(dòng)脈病變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10],將其分為心血管受累組和心血管未受累組。心血管受累組20 例,年齡(1.36±0.81)歲,男12 例,女8 例;心血管未受累組60 例,年齡(1.58±0.65)歲,男42 例,女18 例。對(duì)照組:隨機(jī)選取我院門診常規(guī)體檢的30 名健康兒童(除外先天性心臟及血管疾病),年齡3 個(gè)月至8 歲。KD 組與對(duì)照組年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 標(biāo)本采集 KD 患兒分別采集入院后且使用藥物治療前和經(jīng)過(guò)IVIG 治療1 周后的血液標(biāo)本,所有病人采集清晨空腹靜脈血,經(jīng)EDTA-K2抗凝,離心后(3 000 r/min)的血漿轉(zhuǎn)入EP 管,保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 儀器與檢測(cè)方法 miR-223-3p 檢測(cè)采用Real-time法,使用7500 fast 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國(guó)ABI),試劑購(gòu)自中國(guó)吉瑪公司;通過(guò)瑞典Anthosht2 酶標(biāo)儀檢測(cè)MMP-9 水平,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定,試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司。C-反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)使用OLYMPUS 公司生產(chǎn)的生化分析儀AU2700 檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,不符合正態(tài)分布則采用中位數(shù)和四分位間距(interquartile range,IQR)表示;計(jì)數(shù)資料以率表示。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)或者方差分析;不滿足正態(tài)分布則采用基于秩次的非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用四格表或者R×C 列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)。多因素分析采用非條件Logistic 回歸模型。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3 組急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比較 心血管受累組、心血管未受累組急性期(靜脈注射IVIG 治療前1～10 d)miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 水平均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);心血管受累組急性期miR-223-3p 水平低于心血管未受累組,急性期MMP-9、CRP、ESR、WBC 水平均高于心血管未受累組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 3 組急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比較(±s)

表1 3 組急性期miR-223-3p、MMP-9、CRP、ESR、WBC 比較(±s)

與對(duì)照組比較,①P ＜0.05;與心血管未受累組比較,②P ＜0.05。

組別 樣本量 miR-223-3p MMP-9(pg/mL) CRP(mg/L) ESR(mm/h) WBC(×109/L)心血管受累組 20 3.21±0.01①② 789.38±94.70①② 48.39±12.59①② 89.34±21.46①② 20.43±8.38①②心血管未受累組 60 4.26±0.01① 280.20±66.18① 26.58±6.44① 24.47±12.52① 15.87±5.47①對(duì)照組 30 0.98±0.01 80.40±43.75 0.35±0.01 16.48±5.47 9.48±4.93

2.2 KD 患兒經(jīng)IVIG 治療前后miR-223-3p、MMP-9水平比較 心血管受累組經(jīng)IVIG 治療1 周后血漿miR-223-3p 和MMP-9 水平較治療前明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);心血管未受累組IVIG 治療前后血漿miR-223-3p水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);心血管未受累組IVIG 治療后血漿MMP-9水平較治療前明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 KD 患兒經(jīng)IVIG 治療前后miR-223-3p、MMP-9 水平比較(±s)

表2 KD 患兒經(jīng)IVIG 治療前后miR-223-3p、MMP-9 水平比較(±s)

與同組治療前比較,①P ＜0.05。

組別 例數(shù) miR-223-3p MMP-9(pg/mL)治療前 治療后治療前 治療后心血管受累組 20 3.21±0.01 1.39±0.02① 789.38±94.70 205.62±39.43①心血管未受累組 60 4.26±0.01 4.18±0.02 280.20±66.18 110.50±29.28①

3 討 論

近年來(lái),KD 發(fā)病率出現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì),KD 易累及心血管系統(tǒng),特別是冠狀動(dòng)脈,嚴(yán)重影響預(yù)后,成為成人冠心病的重要危險(xiǎn)因素[11]。目前KD 發(fā)病機(jī)制尚未明確,診斷主要依靠臨床癥狀、體征和心臟超聲及實(shí)驗(yàn)室檢查,但不能早期發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈損傷。探討KD的發(fā)病機(jī)制并尋找早期反映KD 冠狀動(dòng)脈損傷的血清學(xué)指標(biāo),對(duì)KD 的臨床診治至關(guān)重要。

miRNA 是一類非編碼RNA,通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR 或CDS 序列配對(duì),直接或間接地抑制mRNA的翻譯,在許多生理過(guò)程中表現(xiàn)出強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用,包括細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡[12]。miRNA 的異常表達(dá)已被證實(shí)與人類各種疾病,包括癌癥、心血管疾病和炎性病癥相關(guān)[13-14]。有研究報(bào)道,骨髓源的miR-223可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)分泌遺傳信號(hào),能夠進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞,具有調(diào)節(jié)其增殖、凋亡等作用[15]。最近的研究表明,miR-223 參與慢性腎臟病(CKD)實(shí)驗(yàn)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[16]。還有研究發(fā)現(xiàn),miR-223作為胰島素樣生長(zhǎng)因子1 的受體,可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[17]。這均表明miR-223 可能與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)。miR-223-3p 由miR-223 的3"端臂產(chǎn)生[18]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)被確認(rèn)為miR-223-3p的靶基因,IL-6 / STST3 信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[19]。KD 是引起兒童多系統(tǒng)血管炎的重要發(fā)熱性疾病,miR-223-3p 很可能參與了KD 引起的血管炎性過(guò)程。

KD 是兒童全身性血管炎的最常見(jiàn)原因,全身中小動(dòng)脈均可受累,其中為心臟提供血液的冠狀動(dòng)脈最易受累,其病理改變的基礎(chǔ)主要是免疫系統(tǒng)異常激活導(dǎo)致炎性細(xì)胞形成透壁性炎性反應(yīng),從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解,血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,進(jìn)一步導(dǎo)致中膜變薄直至彈性內(nèi)膜的破壞,最終形成冠狀動(dòng)脈損傷,而上述病理過(guò)程均與MMP 家族有關(guān)[8]。MMP 是一種由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生的酶,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)[5-6]。過(guò)度表達(dá)和激活MMP 可誘導(dǎo)組織破壞,并且還與許多特定疾病(包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牙周疾病、癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化)相關(guān)[5-7]。大多數(shù)MMP 可以裂解幾種類型的基質(zhì)成分,并可能降解重疊的底物,例如膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。在MMP 家族中,MMP-2(72 kDa形式)和MMP-9(92 kDa 形式)具有特殊彈性分解活性[20-21]。MMP-9 可能與炎癥性血管疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān),通過(guò)降解內(nèi)部彈性板層,例如巨細(xì)胞動(dòng)脈炎[22]和顳動(dòng)脈炎[23]。在KD 患兒合并冠狀動(dòng)脈損傷時(shí)血液中MMP-9 增加,可通過(guò)損傷內(nèi)皮間隙彌散至內(nèi)皮下并被激活,造成基底膜屏障、內(nèi)皮下彈力纖維層的破壞[8]。

本研究結(jié)果顯示,心血管受累組和心血管未受累組急性期miR-223-3p、CRP、ESR、WBC 水平均高于對(duì)照組(P＜0.05);心血管受累組急性期CRP、ESR、WBC 水平均高于心血管未受累組(P＜0.05),miR-223-3p水平低于心血管未受累組(P＜0.05),心血管受累組經(jīng)IVIG 治療1 周后血漿miR-223-3p 水平較治療前明顯下降(P＜0.05),提示miR-223-3p 可早期反映KD冠狀動(dòng)脈損傷,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示,心血管受累組和心血管未受累組急性期MMP-9 水平均高于對(duì)照組(P＜0.05);心血管受累組急性期MMP-9 水平高于心血管未受累組(P＜0.05),提示MMP-9 的增高可能在血管炎性損傷尤其是冠狀動(dòng)脈損傷中發(fā)揮重要作用。在使用IVIG 治療后,心血管受累組血清MMP-9 水平雖然較治療前明顯下降,但仍高于對(duì)照組,表明KD 患兒治療后雖臨床癥狀改善,但其冠狀動(dòng)脈的炎性病理?yè)p傷過(guò)程可能依然存在。

綜上所述,通過(guò)對(duì)miR-223-3p 與MMP-9 的聯(lián)合檢測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-223-3p、MMP-9 可能與KD 冠狀動(dòng)脈損傷相關(guān),有望作為識(shí)別KD 患兒冠狀動(dòng)脈早期損傷的指標(biāo)。