新生SD 大鼠心肌成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法

劉 真,楊志玲,劉曉艷

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,如高血壓及高血壓性心臟病、急性心肌梗死、心肌炎等各種心血管疾病的發(fā)病率逐漸升高,成為影響人們身體健康和生活質(zhì)量的“殺手”,其從發(fā)生、發(fā)展到一定階段的共同病理改變是心肌纖維化,心肌纖維化又是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一,心室重構(gòu)和心肌纖維化主要是由于心肌成纖維細(xì)胞過度增殖及分泌膠原纖維功能增強(qiáng)所致,心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFs)從體積上僅占整個(gè)心臟體積的25%,但從其數(shù)目上卻占正常心肌組織細(xì)胞總數(shù)的60%～70%,由此可見,成纖維細(xì)胞對于心臟穩(wěn)態(tài)的維持有著重要作用[1]。因此,研究心肌成纖維細(xì)胞對于現(xiàn)代心血管疾病的研究也具有重要意義。本研究探討新生SD 大鼠心肌成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生后48 h 以內(nèi)的健康SD 大鼠10 只,雌雄相混,SPF 級,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 D-Hanks 液(Solarbio),胰蛋白酶(含EDTA,Gibco),胎牛血清(FCS,四季青浙江天杭生物技術(shù)有限公司),DME/F-12(HyClone),P/S 雙抗青鏈霉素(Gibco),兔抗波形蛋白單克隆抗體(abcam),羊抗兔IgG(Solarbio),DAB 濃縮型試劑盒(Solarbio),5%BSA 封閉液(Solarbio)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司),超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),低速離心機(jī)(金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠),倒置生物顯微鏡(LEICA DMI3000 B),光學(xué)顯微鏡(LEICA),冰箱(青島海爾股份有限公司),干燥箱、雪花制冰機(jī)及高壓蒸汽滅菌鍋均為松下電器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)方法[2]用含75%乙醇消毒新生SD 乳鼠表面皮膚,約30 s 后用無菌干棉球?qū)⑵浔砥げ潦酶蓛?于超凈工作臺(tái)中用組織鑷撕開乳鼠心臟處表層皮膚,立即用無菌眼科剪緊貼乳鼠胸骨劍突左緣向上迅速剪斷胸骨,稍用力遂可擠出跳動(dòng)的乳鼠心臟,更換另一把無菌眼科剪快速取下暴露的心尖部位,大小為2 mm×2 mm×2 mm,將取下的乳鼠心尖置于裝有預(yù)冷的D-Hanks 液的玻璃培養(yǎng)皿中,更換無菌組織剪進(jìn)行心尖組織的初步粗剪,用3 mL 吸管在含D-Hanks 液的玻璃培養(yǎng)皿中將心尖組織進(jìn)行輕輕吹洗操作,以盡可能除去殘留的血細(xì)胞,更換D-Hanks 液輕輕吹洗3 次或4 次,至組織塊顏色變白,更換無菌組織剪將其剪成大小約1 mm3小塊后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中。加入約10 倍體積的0.25%胰蛋白酶消化液,離心管中輕輕吹打?qū)⑾夯靹?置于37.0 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化4 min 后用吸管輕輕吹打離心管中心尖組織塊約30 s 以分散細(xì)胞,待組織塊自然沉降后,棄掉含消化液的上清液。重復(fù)以上操作,每次消化約5 min 后收集細(xì)胞,置于冰盒中等量的含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、89%DME/F-12 的完全培養(yǎng)液中終止胰酶消化。其中胰酶消化第2 次時(shí)組織塊即可成為黏稠絲狀物質(zhì),基本分次消化4 次或5 次時(shí)組織塊可消失。將分次收集到的細(xì)胞懸液以1 000 r/min,5 min 集中離心沉淀,所獲細(xì)胞沉淀加入適量完全培養(yǎng)液,用吸管輕輕反復(fù)吹打分散細(xì)胞,用3 mL 離心管將含懸浮細(xì)胞的完全培養(yǎng)液接種均分裝到5 個(gè)培養(yǎng)瓶中,每瓶加入完全培養(yǎng)液4 mL,放入37.0 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置1 h 后(差速貼壁分離法),輕輕吸出上懸液后棄掉,加入2 mL D-Hanks 液漂洗棄掉,再加入完全培養(yǎng)基4 mL 后將培養(yǎng)瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后進(jìn)行第1 次D-Hanks 液漂洗、完全培養(yǎng)液換液,之后每間隔48 h 進(jìn)行1 次換液。當(dāng)心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí),以0.25%胰蛋白酶消化傳代(1∶2),第2 代～第3 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)及鑒定。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 在倒置生物顯微鏡下觀察心肌成纖維細(xì)胞從剛接種時(shí)的懸浮狀態(tài),到逐漸貼壁、爬片融合成片層的變化過程。顯微鏡下對心肌成纖維細(xì)胞的外觀形態(tài)、大小特征,內(nèi)部細(xì)胞核特征以及心肌成纖維細(xì)胞的生長、增殖等情況進(jìn)行直接觀察并照相記錄。觀察時(shí)間盡可能控制在10 min 內(nèi),以免細(xì)胞長時(shí)間離開培養(yǎng)箱,尤其注意不要使細(xì)胞受到污染[2-4]。

1.2.3 Vimentin 免疫組化法鑒定[5-6]取第2 代的心肌成纖維細(xì)胞,105個(gè)/mL 接種于6 孔板中,每孔2 mL,爬片2～3 d 后處理,預(yù)冷(4 ℃),0.01 mmol/L 磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕輕沖洗細(xì)胞爬片3 次,每次5 min,室溫下75%乙醇固定30 min,PBS 溶液重復(fù)上述步驟沖洗,3%甲醇-過氧化氫孵育10 min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS 溶液沖洗,0.1% TritonX-100 室溫處理15 min,PBS 溶液沖洗,5%BSA 小牛血清室溫封閉1 h,加入一抗(1∶200)置于4 ℃冰箱中濕盒孵育過夜,復(fù)溫,PBS 液沖洗,加入二抗(1∶200)室溫避光1 h;PBS 溶液沖洗,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP;1∶300)室溫避光45 min,PBS 溶液沖洗,加入DAB 顯色液,隨時(shí)在顯微鏡下觀察,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒時(shí)將玻片放于清水中終止反應(yīng);蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2 min,清水洗4次或5 次,進(jìn)行梯度乙醇脫水各3 min,以及二甲苯透明Ⅰ、Ⅱ各3 min;取適量樹膠進(jìn)行最后封片處理。在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照記錄[3]。PBS 代替一抗為空白陰性對照。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞剛分離時(shí)呈大小不一的圓形,折光性強(qiáng),懸浮于培養(yǎng)液中,尚未貼壁。1 h 后可見大部分心肌成纖維細(xì)胞已貼壁,折光性較前變?nèi)酢?.5 h 后可見心肌成纖維細(xì)胞基本已完全貼壁生長且部分細(xì)胞有偽足伸出(小突起),均勻分布于培養(yǎng)基中,可見清晰細(xì)胞核,無聚集成團(tuán)生長。24 h 后可見細(xì)胞呈長梭形、多角形或泡狀生長,胞體相對心肌細(xì)胞較大,胞漿呈透明無色,細(xì)胞核較大,核呈色淡的橢圓形,多數(shù)細(xì)胞呈雙核和三核。心肌成纖維細(xì)胞生長迅速,2～3 d 即可融合成片層,細(xì)胞呈緊密排列狀態(tài),偶可呈現(xiàn)交叉、重疊生長,一般無聚集成團(tuán)生長,培養(yǎng)過程中細(xì)胞未見明顯自發(fā)搏動(dòng)。詳見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.2 Vimentin 免疫組化法鑒定結(jié)果 陽性結(jié)果判斷[2]:心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白呈強(qiáng)陽性反應(yīng),以細(xì)胞漿內(nèi)圍繞細(xì)胞核呈黃色或棕褐色顆粒狀改變?yōu)殛栃浴ｊ幮越Y(jié)果判斷[2]:心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫組化空白對照不著色即為陰性。Vimentin 免疫組化法進(jìn)行心肌成纖維細(xì)胞鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞波形蛋白染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng),因此,采用胰蛋白酶消化,經(jīng)差速貼壁分離法得到的細(xì)胞即為心肌成纖維細(xì)胞。詳見圖2。

圖2 Vimentin 免疫組化法陽性鑒定結(jié)果

3 討 論

目前心血管疾病已成為威脅人類健康的重要病種之一,而心力衰竭又是心血管疾病終末期階段,其病理生理學(xué)改變主要為心肌纖維化,其又是多種心臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,致心臟重構(gòu),進(jìn)而致重構(gòu)的心室順應(yīng)性差,嚴(yán)重影響心臟的舒張與收縮功能,導(dǎo)致心功能進(jìn)一步向失代償期進(jìn)展。而成纖維細(xì)胞是心肌梗死后心力衰竭病人心肌纖維化的主要功能細(xì)胞,對心室重構(gòu)起到了關(guān)鍵作用[7]。陳希等[8]認(rèn)為心肌成纖維細(xì)胞不僅對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用,而且還能影響心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能。因此,對成纖維細(xì)胞的生理學(xué)研究也成為心血管疾病研究的熱點(diǎn)問題。本實(shí)驗(yàn)通過分析心肌組織處理及細(xì)胞分離過程中的相關(guān)參數(shù),證實(shí)了采用胰蛋白酶消化經(jīng)差速貼壁法分離心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)方法完全可行,為體外實(shí)驗(yàn)研究的開展提供了保障。

在心肌成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)過程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①本實(shí)驗(yàn)選用出生48 h 以內(nèi)新生SD 乳鼠,原因在于心肌細(xì)胞隨著大鼠年齡的增長,其增殖分化能力也隨之減弱,心肌成纖維細(xì)胞增殖能力亦然,因此,選擇鼠齡時(shí),盡量選擇出生時(shí)間短的乳鼠,成纖維細(xì)胞成活率及貼壁率會(huì)更高,利于實(shí)驗(yàn)研究[4]。②胰蛋白酶消化心臟組織。孫剛等[9]通過膠原酶+胰蛋白酶消化法和單純采用胰酶消化法對新生大鼠心肌組織進(jìn)行消化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),單獨(dú)采用胰蛋白酶消化法獲得的心肌成纖維細(xì)胞對藥物具有更強(qiáng)的增殖反應(yīng)能力,本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了單純采用胰蛋白酶消化心臟組織提取心肌成纖維細(xì)胞是可行的,另外,本實(shí)驗(yàn)注意控制消化過程中的溫度,一般在37.0 ℃,溫度過低可能導(dǎo)致組織塊消化不充分,溫度過高不僅降低酶的活性也會(huì)對細(xì)胞造成損害,進(jìn)而影響心肌成纖維細(xì)胞貼壁速度以及質(zhì)量。③離心速率選擇1 000 r/min,時(shí)間控制在5 min,目的是減少對心肌成纖維細(xì)胞的機(jī)械性損傷。④本實(shí)驗(yàn)采用差速貼壁法除去大部分心肌細(xì)胞,利用心肌成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞貼壁快的特性1 h 時(shí)棄掉上層懸浮液[10],加用D-Hanks 漂洗減少了心肌細(xì)胞的存留機(jī)會(huì),進(jìn)而保證了心肌成纖維細(xì)胞的純度,且操作簡便、重復(fù)性良好。⑤本實(shí)驗(yàn)方法基本滿足2 只新生SD 乳鼠配一個(gè)25 mL 培養(yǎng)瓶,且保證了細(xì)胞密度及存活率,滿足36～72 h 可傳代1 次的要求。