瘦素激活PI3K/Akt信號(hào)通路分泌白介素8促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

王林，樊清清，段雯婷，王維

1.西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710002；2.西安市第一醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710002；3.西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710002；4.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003

越來(lái)越多的流行病學(xué)證據(jù)表明，以脂肪堆積過(guò)多為特征性病變的肥胖，已經(jīng)快速發(fā)展成全球性的健康問(wèn)題[1]。肥胖不僅可以引起身體各種代謝并發(fā)癥，亦可增加患者罹患多種激素依賴性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)顯著促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后過(guò)程，此現(xiàn)象在絕經(jīng)后婦女乳腺癌患者的病例中尤為顯著[2-4]。眾所周知，細(xì)胞因子、炎性趨化因子和脂肪因子分泌失調(diào)所導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞增生、肥大參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。在眾多因子中，有致癌性的脂肪因子——瘦素(Leptin)，被認(rèn)為是關(guān)聯(lián)肥胖和乳腺癌的一種最重要的分子中介。相比于正常乳腺上皮細(xì)胞，瘦素在乳腺腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[5-7]。另有研究表明，Leptin 受體(Ob-R)廣泛表達(dá)于人體內(nèi)各種組織及腫瘤細(xì)胞上，Leptin 通過(guò)與腫瘤細(xì)胞上的Ob-R 結(jié)合可誘導(dǎo)其生存、遷移、侵襲等特性[8-9]。事實(shí)上除了研究Leptin 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程，人們對(duì)于Leptin 在乳腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)過(guò)程中所發(fā)揮的作用較少研究。

EMT 是貼壁上皮樣細(xì)胞到間充質(zhì)樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的過(guò)程，在胚胎形成、組織修復(fù)、傷口愈合以及各種病理情況如惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。近期研究表明EMT 是多種癌癥進(jìn)展中的一個(gè)重要的啟動(dòng)因子，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及不良預(yù)后關(guān)系緊密[7，10-12]。發(fā)生EMT 的細(xì)胞，其上皮細(xì)胞標(biāo)志物鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)受抑制，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白(Vimentin)表達(dá)升高。研究表明發(fā)生EMT的癌細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子，如白介素8(IL-8)[13]。IL-8是一種由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌的趨化因子，和包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖、血管形成、侵襲移擴(kuò)散等過(guò)程密切相關(guān)[14]。

本研究以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為體外研究對(duì)象，分析Leptin 對(duì)其EMT 的作用并以趨化因子IL-8 為切入點(diǎn)探討其可能的分子途徑，為L(zhǎng)eptin 參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡明提供依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料 人MCF-7乳腺癌細(xì)胞株由西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科保存；Leptin 購(gòu)買于Peprotech 公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)買于Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)買于杭州四季青生物研究所；SDS-PAGE 蛋白緩沖液和封閉蛋白購(gòu)買于武漢；蛋白Marker購(gòu)買于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)買于碧云天生物研究所；HRP 發(fā)光試劑購(gòu)買于Millipore公司；兔抗人Ob-R和IL-8 抗體購(gòu)買于Santa Cruz 公司；兔抗人p-AKT、AKT 抗體購(gòu)買于Cell Signaling 公司；兔抗人E-cadherin、Vimentin，鼠 抗 β-actin 抗 體 均 購(gòu) 買 于Bioworld公司；二抗購(gòu)于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7 細(xì)胞用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光法檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞Leptin 受體Ob-R蛋白表達(dá) 取常規(guī)培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以3×105/孔的濃度于6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞加入兔抗人Ob-R(1:100)及FITC標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG 1:1 000稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)，其中細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色。

1.2.3 顯微鏡觀察Leptin 對(duì)MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Leptin 處理組，取對(duì)數(shù)期的MCF-7 細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L 胰酶消化和磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用DMEM 培養(yǎng)液重懸，使細(xì)胞濃度為3×105/mL，按100 μL/孔的量加入 6 孔板中，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng) 16 h，細(xì)胞同步化后，經(jīng) 3 遍 PBS 清洗后加入DMEM培養(yǎng)液，PBS組、Leptin組分別經(jīng)PBS及100 ng/mL Leptin處理，作用48 h 后，于顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 Western blot 法檢測(cè) Leptin 對(duì) MCF-7 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白 E-cadherin、Vimentin 表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.2.3，作用48 h 后，按試劑盒要求提取總蛋白，取120 μg 總蛋白行100 g/L SDS-PAGE，經(jīng)干轉(zhuǎn)的PVDF膜以TBST(含50 g/L脫脂奶粉)4℃封閉4 h后加入兔抗人E-cadherin，Vimentin(1∶1 000)一抗于4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)2次TBST洗滌和1次TBS洗滌；加入二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000 稀釋)室溫孵育1 h，重復(fù)洗滌過(guò)程；滴加HRP 發(fā)光試劑，于暗室靜置2 min，應(yīng)用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Quantity One4.6.6 軟件分析條帶光度值，檢測(cè)經(jīng)Leptin 作用后MCF-7 細(xì)胞 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè) Leptin 對(duì) MCF-7 細(xì)胞IL-8 分泌及信號(hào)通路分子p-AKT 表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞處理及Western blot 檢測(cè)方法同上，其中一抗兔抗人 p-AKT、AKT，兔抗人 IL-8 按 1∶1 000 稀釋。檢測(cè)經(jīng)Leptin作用后MCF-7細(xì)胞IL-8、p-AKT蛋白的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫熒光法檢測(cè)IL-8 在Leptin 促M(fèi)CF-7細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用 實(shí)驗(yàn)分為PBS組、Lepin組、Leptin+anti-IL-8組及Leptin+IgG組。后兩組在Leptin處理前1 h，分別加入IL-8 特異性抗體(1 μg/mL)及對(duì)照抗體IgG，孵育48 h，加入兔抗人E-cadherin、Vimentin (1∶100 稀釋)及 FITC 標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000 稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7 細(xì)胞Ob-R 的表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)表明 MCF-7 細(xì)胞 Ob-R 有表達(dá)(圖 1)。

圖1 免疫熒光檢測(cè)MCF-7細(xì)胞上Ob-R的表達(dá)(×400)

圖2 顯微鏡觀察Leptin對(duì)MCF-7細(xì)胞EMT過(guò)程的影響(×200)

2.2 Leptin對(duì)MCF-7細(xì)胞EMT過(guò)程的影響 顯微鏡形態(tài)觀察(圖2)檢測(cè)表明Leptin能引起MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT改變，形態(tài)表現(xiàn)為極性消失，黏附性下降，細(xì)胞間連接變松散。Western blot法(圖3)檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin蛋白的相對(duì)表達(dá)量，其中 E-cadherin 的表達(dá) Leptin 組(0.14±0.04)較PBS 組(0.84±0.06)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.033，P＜0.05)，Vimentin 的表達(dá)Leptin 組(1.04±0.14)較PBS 組(0.12±0.02)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.153，P＜0.05)。 以 上 結(jié) 果 均 表 明 Lepin 可 促 進(jìn)MCF-7細(xì)胞上EMT過(guò)程。

圖3 Western blot檢測(cè)Leptin對(duì)MCF-7細(xì)胞EMT過(guò)程的影響

2.3 Leptin 促進(jìn) MCF-7 細(xì)胞 p-Akt 的表達(dá)及IL-8 的分泌 Western blot 法(圖 4)檢測(cè) p-Akt、Akt、IL-8 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，其中p-Akt 的表達(dá)Leptin 組(0.81±0.07)較PBS組(0.11±0.03)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.566，P＜0.05)，Akt 的表達(dá) Leptin 組(0.91±0.04)較PBS 組(0.89±0.07)上調(diào)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.349，P＞0.05)，IL-8 的表達(dá) Leptin 組(0.90±0.07)較PBS 組(0.14±0.03)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.239，P＜0.05)。

2.4 IL-8在Leptin促M(fèi)CF-7細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用 免疫熒光結(jié)果(圖5)顯示，相對(duì)于Leptin+IgG組，Leptin+anti-IL-8 組上皮相關(guān)分子 E-cadherin 相對(duì)熒光表達(dá)量由29.73±1.51 降低為6.29±0.54，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.23，P＜0.05)；間質(zhì)相關(guān)分子Vimentin 相對(duì)熒光表達(dá)量由 3.90±0.39 升高為 23.38±0.81，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.55，P＜0.05)。表明Leptin促M(fèi)CF-7 細(xì)胞EMT 作用可被IL-8 的特異性抗體逆轉(zhuǎn)，即Leptin 主要通過(guò)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞分泌IL-8進(jìn)而介導(dǎo)其EMT過(guò)程。

圖 4 Western blot 檢測(cè) Leptin 對(duì) MCF-7 細(xì)胞 p-AKT 的表達(dá)及IL-8 分泌的影響

圖5 Western blot檢測(cè)IL-8在Leptin促M(fèi)CF-7細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用(×400)

3 討論

EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，參與胚胎發(fā)生、傷口愈合、組織再生等過(guò)程。近年來(lái)EMT在多種腫瘤包括乳腺癌的形成、發(fā)展中發(fā)揮的作用成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。發(fā)生EMT過(guò)程的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用被重塑，導(dǎo)致上皮細(xì)胞之間以及上皮細(xì)胞與基底膜之間的黏附性降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移以及增加了腫瘤對(duì)臨床干預(yù)的耐受[15-17]。

Leptin 是一種脂肪組織分泌的激素，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞EMT 過(guò)程，包括乳腺癌。Leptin 所誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生發(fā)展是否與其促進(jìn)EMT過(guò)程相關(guān)以及所涉及的中介分子和信號(hào)級(jí)聯(lián)機(jī)制有哪些成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究表明腫瘤EMT 的發(fā)生依賴于腫瘤微環(huán)境中的各種可溶性生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或細(xì)胞外基質(zhì)成分等信號(hào)刺激，包括EGF、TGF-β、IL-6、IL-8 等因子，這些細(xì)胞因子在各類癌癥中均可促進(jìn)EMT過(guò)程[13]。IL-8與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲遷移密切相關(guān)，有報(bào)道乳腺癌患者血清IL-8水平與腫瘤進(jìn)展和生存率降低呈正相關(guān)，然而機(jī)制尚不明確。本文以IL-8為切入點(diǎn)，研究Leptin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞EMT過(guò)程的影響，以及探索其可能涉及的機(jī)制和信號(hào)通路。

本研究結(jié)果顯示，MCF-7 細(xì)胞中有Leptin 受體Ob-R 的表達(dá)。Leptin 能促進(jìn) MCF-7 的 EMT 過(guò)程，形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞間黏附性降低，細(xì)胞外基質(zhì)重組，由典型多邊形上皮細(xì)胞形態(tài)向梭形間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。同時(shí)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下降，間充質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)升高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K/AKT信號(hào)通路在Leptin的促腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7，18]，本研究結(jié)果顯示，和PBS組相比，Leptin顯著上調(diào)MCF-7細(xì)胞p-Akt的表達(dá)，促進(jìn)MCF-7細(xì)胞IL-8 的分泌。為進(jìn)一步探討IL-8 在Leptin 所介導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用，采用抗體封閉IL-8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCF-7 細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin 和間充質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)逆轉(zhuǎn)，即Leptin對(duì)MCF-7細(xì)胞的促EMT作用與IL-8介導(dǎo)密切相關(guān)。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究初步斷定Leptin 能促進(jìn)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的EMT 過(guò)程，并推斷其機(jī)制可能與Leptin激活PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)IL-8的表達(dá)有關(guān)，為乳腺癌的生物治療提供了靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是對(duì)于Leptin所誘導(dǎo)分泌的IL-8 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的促EMT效應(yīng)是通過(guò)何種途徑實(shí)現(xiàn)的，其詳細(xì)作用機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步研究。