稻瘟病生防細(xì)菌的篩選及其防效測定

孫正祥，鄭通文，毛國慶，劉璐，陳東，周燚

1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025 2.湖北省農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心(長江大學(xué))，湖北 荊州 434025

水稻是世界上第三大糧食作物，僅次于小麥和玉米，養(yǎng)活了世界上超過50%的人口，其食用價值至關(guān)重要[1]。由稻梨孢(Magnaporthegrisea)侵染引起的稻瘟病是世界范圍內(nèi)危害水稻最嚴(yán)重的病害之一，已蔓延至80多個國家，平均每年造成的產(chǎn)量損失可達(dá)30%[2]。該病害易突發(fā)、流行快，防治難度大。目前,用于防治稻瘟病的措施主要包括農(nóng)業(yè)防治、抗病育種和化學(xué)防治，農(nóng)業(yè)防治雖有效但費時費力；抗病育種難度大、周期長，且品種抗性易喪失；化學(xué)防治會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，且造成環(huán)境污染，危害人體健康[3]。生物防治安全有效且可持續(xù)，具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前報道的稻瘟病生防菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)和假單胞桿菌屬(Pseudomonasspp.)，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[4]、堅強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)[5]、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)[6]和熒光假單胞菌(P.fluorescens)[7]，這些菌株具有良好的室內(nèi)防效，但其田間防效不理想，且難以直接應(yīng)用。因此，篩選更多更優(yōu)質(zhì)的稻瘟病生防細(xì)菌意義重大。研究從對節(jié)白蠟(FraxinushupehensisChiu，ShangetSu)及其根際分離篩選對稻瘟病菌(M.grisea)具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌，測定其離體葉片防效、盆栽防效和產(chǎn)胞外酶活性，以期為稻瘟病的生物防治提供更多的菌源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試稻瘟病菌由長江大學(xué)植物與微生物互作研究室分離與保存；供試水稻品種為麗江新團(tuán)黑谷(感病品種)；供試培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基[8]、燕麥片培養(yǎng)基[9]、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基[10]、脫脂牛奶培養(yǎng)基[10]、鉻天青培養(yǎng)基[10]和幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基[10]。供試對照藥劑為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，由河北省保定市科綠豐生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的分離純化

于長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物園內(nèi)選取2株長勢良好的對節(jié)白蠟，挖取適量根部組織，并收集根際土，將根組織和根際土分別裝在采樣袋中帶回實驗室備用。根際細(xì)菌的分離：取10g根際土，加入90mL無菌水振蕩懸浮，隨后進(jìn)行梯度稀釋，取適量的10-6、10-7、10-8稀釋液分別涂布于NA平板[11]。對節(jié)白蠟內(nèi)生菌分離：稱量1g的根組織，表面消毒后，于無菌研缽中充分研磨，將研磨液梯度稀釋，取適量的10-4、10-5、10-6稀釋液分別涂布于NA平板。將上述的NA平板置于28°C培養(yǎng)箱中，2d后挑取顏色、光澤、邊緣光滑度和厚度不同的單菌落于新的NA平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，所得菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的篩選

初篩：采用平板對峙法[12]篩選稻瘟病菌的拮抗細(xì)菌，28°C培養(yǎng)5d，記錄具有抑菌活性的菌株編號。

復(fù)篩：參照王宇婷等[13]的平板打孔法檢測初篩所得菌株對稻瘟病菌的抑制作用，不同之處是利用無菌打孔器在距離平板中央2cm處三點對稱打孔，每孔注入20μL供試菌株的菌液。待對照平板中病原菌菌絲即將長滿全皿時，測量各處理的病原菌菌落半徑，并計算其抑菌率[14]。

1.4 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的離體葉片篩選

選擇長勢一致的水稻植株(4～5葉期)采集葉片，用無菌剪刀剪成5cm長的片段，經(jīng)次氯酸鈉消毒后平均分為4組，分別進(jìn)行如下處理：待測細(xì)菌發(fā)酵液+稻瘟病菌、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑+稻瘟病菌、NB培養(yǎng)液+稻瘟病菌、待測細(xì)菌發(fā)酵液。

將待測菌株接種至NB培養(yǎng)基中，28°C、130r/min培養(yǎng)48h，利用分光光度計將發(fā)酵液濃度調(diào)至光密度D600nm為1.0，備用。稻瘟孢子懸浮液的制備：將活化的稻瘟病菌接種至燕麥培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7d后每皿加入5mL無菌水洗脫分生孢子獲得懸浮液，并用血球計數(shù)板將分生孢子的濃度調(diào)至1.0×106cfu/mL，向懸浮液中加入0.1%吐溫20[15]，備用。

將葉片浸泡于待測菌株發(fā)酵液中，處理30min后置于鋪有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用無菌牙簽輕刺葉片表面，每段葉片刺傷3個點，在每個點上滴加稻瘟病菌孢子懸浮液5μL，然后將培養(yǎng)皿封口置于溫室(25°C，光照時間∶黑暗時間=16h∶8h)中。以浸泡于枯草芽孢桿菌菌劑溶液為陽性對照，以浸泡于NB為陰性對照，每個處理3次重復(fù)，含水稻葉段18個。3d后參照沙月霞等[16]的方法調(diào)查各處理稻瘟病的病情嚴(yán)重度，并計算相應(yīng)的病情指數(shù)和防效。

1.5 拮抗細(xì)菌對稻瘟病的盆栽防效測定

挑選健康、飽滿的水稻種子浸泡24h，置于28°C培養(yǎng)箱中保濕催芽，露白后播種于裝有無菌泥土的塑料盆中，21d后移栽于塑料桶中，每桶栽種7株。試驗分為3個處理：拮抗細(xì)菌懸浮液+稻瘟病菌、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑+稻瘟病菌、NB培養(yǎng)液+稻瘟病菌。

拮抗細(xì)菌懸浮液和稻瘟病菌孢子懸浮液的制備參照1.4，每處理含有0.02%吐溫80表面活性劑[17]。選取分蘗末期長勢一致的水稻，噴施拮抗細(xì)菌懸浮液，至葉片向下滴水為止，24h后噴施病原菌孢子懸浮液。以噴施NB培養(yǎng)液為對照，每7d噴施1次，連續(xù)噴施2次，每處理4次重復(fù)。第二次噴施藥劑后7d參照沙月霞等[18]的方法調(diào)查各處理葉瘟的病情嚴(yán)重度，并計算相應(yīng)的病情指數(shù)和防效。

1.6 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌產(chǎn)胞外酶活性測定

選擇對稻瘟病防效較好的菌株，檢測其產(chǎn)胞外酶活性。拮抗菌株產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和嗜鐵素的活性測定均參照陳思宇等[10]的方法進(jìn)行，分別測定相應(yīng)的透明圈或暈圈大小并計算平均值，實驗重復(fù)3次。

1.7 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的鑒定

選擇拮抗作用較強(qiáng)的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。使用OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取拮抗細(xì)菌的DNA，采用16S rDNA基因通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。取少量PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產(chǎn)物送至擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將所得序列分別在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫采用BLAST程序進(jìn)行同源性搜索比對，通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，檢驗組間差異顯著性，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

表1 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的來源和相對抑菌率

圖1 菌株YZU-S033和YZU-S061對稻瘟病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of strain YZU-S033 and strain YZU-S061 on M. grisea

2.1 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的分離和篩選

從對節(jié)白蠟及其根際共分離獲得193株細(xì)菌，通過篩選得到7株對稻瘟病菌有抑制作用的菌株，其中根際細(xì)菌YZU-S033和YZU-S061的拮抗能力較強(qiáng)，抑菌率分別為75.47%和73.30%(見表1、圖1)。

2.2 稻瘟病菌拮抗細(xì)菌的離體葉片篩選

篩選出的7個菌株在離體葉片試驗中均能減輕稻瘟病的發(fā)病程度，其中菌株YZU-S033和YZU-S061對稻瘟病的防效最好。對照水稻葉片的病情指數(shù)為60.5，而經(jīng)菌株YZU-S033和YZU-S061處理的水稻葉片病情指數(shù)分別為11.1和18.5，其防效分別為81.7%和69.4%，明顯優(yōu)于枯草芽孢桿菌菌劑的防效(61.5%)(見表2、圖2)。選擇菌株YZU-S033和YZU-S061進(jìn)行后續(xù)實驗。

(a)稻瘟病菌+NB；(b)稻瘟病菌+枯草芽孢桿菌可濕性粉劑； (c)稻瘟病菌+YZU-S033；(d)稻瘟病菌+YZU-S061； (e)YZU-S033；(f)YZU-S061。 圖中紅色箭頭標(biāo)注的是稻瘟病病斑。 圖2 菌株YZU-S033和YZU-S061對稻瘟病的離體葉片防效Fig.2 Control effects of YZU-S033 and YZU-S061 on rice blast in detached leaf assay

表2 不同菌株對稻瘟病的離體相對防效

2.3 拮抗細(xì)菌對稻瘟病的盆栽防效測定

盆栽試驗結(jié)果顯示，對照組水稻的病情指數(shù)為24.2，經(jīng)菌株YZU-S033和YZU-S061處理后的水稻病情指數(shù)分別為7.3和8.7。2個菌株對稻瘟病的防效分別為69.8%和64.0%，與對照藥劑防效相當(dāng)(見表3)。

2.4 拮抗細(xì)菌產(chǎn)胞外酶活性測定

菌株YZU-S033和YZU-S061均能產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶，其降解圈的直徑均大于10mm，但二者均不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶(見表4、圖3)。此外，菌株YZU-S061還能分泌嗜鐵素。

表3 2株拮抗菌株對稻瘟病的盆栽相對防效

表4 菌株YZU-S033和YZU-S061產(chǎn)胞外酶活性測定結(jié)果

圖3 菌株YZU-S033和YZU-S061產(chǎn)胞外酶活性Fig.3 Extracellular enzyme activity of strain YZU-S033 and strain YZU-S061

2.5 菌株YZU-S033和YZU-S061的鑒定

BLAST結(jié)果顯示，菌株YZU-S033和YZU-S061的序列均與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)Y9的序列具有99%的相似度。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2個菌株都和貝萊斯芽孢桿菌在同一分支上(見圖4)，初步鑒定菌株YZU-S033和YZU-S061均為貝萊斯芽孢桿菌。

圖4 基于菌株YZU-S033和YZU-S061的16S rDNA序列及其相似序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences of strain YZU-S033 and strain YZU-S061 and their homologous sequences

3 討論與結(jié)論

目前國內(nèi)外已有不少關(guān)于篩選和利用拮抗細(xì)菌防治稻瘟病的報道[8，20，21]，但這些菌株大多來源較為單一，難以發(fā)揮穩(wěn)定的生防作用。對節(jié)白蠟是我國特有的一種藥用植物，其生長過程中鮮有病蟲害發(fā)生，有研究表明這可能與其自身產(chǎn)生的活性物質(zhì)有關(guān)[22]，而這些物質(zhì)可能來自其內(nèi)生細(xì)菌或根際細(xì)菌。研究從對節(jié)白蠟及其根際分離篩選稻瘟病菌的拮抗菌，獲得拮抗效果較好的細(xì)菌2株，其抑菌率均在70%以上，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

沙月霞等[23]分離得到的貝萊斯芽孢桿菌E69對稻瘟病菌具有良好的平板抑制效果，其盆栽防效可達(dá)83.24%。筆者研究結(jié)果與之相似。菌株YZU-S033和YZU-S061在離體葉片試驗中對稻瘟病的防效分別為81.7%和69.4%，對稻瘟病的盆栽防效為69.8%和64.0%。與離體葉片防效相比，盆栽防效略微偏低，可能原因是接種病菌后水稻培養(yǎng)時間偏短，導(dǎo)致稻瘟病發(fā)病程度較輕。

拮抗細(xì)菌分泌的多種胞外酶均可破壞植物病原真菌菌絲的細(xì)胞壁，使病原菌無法完成菌絲生長、孢子萌發(fā)等代謝過程，從而達(dá)到預(yù)防植物病害的目的[24]。此外，拮抗細(xì)菌可通過產(chǎn)生和利用嗜鐵素，與環(huán)境中的病原微生物競爭鐵離子，使其因缺乏鐵元素而無法正常生長和繁殖，從而控制植物病害的發(fā)生[25]。研究中，菌株YZU-S033和YZU-S061產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶的能力較強(qiáng)，其中菌株YZU-S061還可分泌嗜鐵素，說明產(chǎn)生胞外酶和嗜鐵素是其生防作用機(jī)制之一。

研究還篩選得到了2株對稻瘟病具有良好防效的菌株，并對其機(jī)制進(jìn)行了初步研究。然而，這2株拮抗細(xì)菌對稻瘟病的田間防效還有待進(jìn)一步研究。此外，后續(xù)研究還將探討其定殖性和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生等特性，為拮抗菌株的開發(fā)應(yīng)用提供更多的實踐基礎(chǔ)。