古細(xì)菌Halobacterium salinarum耐熱因子的研究

張栩 崔珊珊

摘? 要：該研究使用的Halobacterium salinarum是極端嗜鹽菌的模型生物之一。通過(guò)對(duì)菌熱處理后，添加培養(yǎng)濾液，進(jìn)行37℃振蕩培養(yǎng)，測(cè)量OD600值觀察菌的生長(zhǎng)情況，以確定該菌是否含有耐熱因子及探討了該菌培養(yǎng)濾液中所含成分對(duì)該菌生長(zhǎng)繁殖的影響。結(jié)果，80 ℃熱處理后，如果不添加培養(yǎng)濾液，該菌不生長(zhǎng);添加培養(yǎng)濾液時(shí)，從第十天左右開始，OD600≈0.2～0.3，并且通過(guò)顯微鏡的觀察，確認(rèn)了菌的存在。另外，將培養(yǎng)濾液用活性炭進(jìn)行吸附，再用乙醇進(jìn)行溶出后的效果也進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：將100%的乙醇溶出液分別加入熱處理菌后進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果70 ℃的熱處理菌有生長(zhǎng)延遲的傾向?？梢酝茢喑觯号囵B(yǎng)濾液中有可能存在某種阻礙該菌生長(zhǎng)的成分。根據(jù)該研究，明確證實(shí)了培養(yǎng)濾液中既含有Halobacterium salinarum的生長(zhǎng)促進(jìn)因子，又含有阻礙因子。通過(guò)分析這些成分，期待可以將休眠機(jī)制解釋清楚并對(duì)該菌以外的極端嗜鹽菌的耐熱性的研究提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：極端嗜鹽菌? Halobacterium salinarum? 耐熱因子? 培養(yǎng)濾液

中圖分類號(hào)：Q939??????????????????????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? ???????????? 文章編號(hào)：1672-3791（2021）01（a）-0094-03

Study on Heat Resistance Factor of Halobacterium Salinarum

ZHANG Xu?? CUI Shanshan

（Changchun Polytechnic， Changchun， Jilin Province， 130000 China）

Abstract： Halobacterium salinarum is a model organism of extreme halophiles. In this study， firstly， we collected the culture filtrate of the halophile culture solution which continued to shake culture at 37 ℃ after heat shock at different temperature. Then we continue to culture the heat-activated halophile by using the medium with the culture filtrate， and observed the growth by measuring the OD600 value to determine whether the halophile contains heat-resistant factors. Simultaneously exploring the effects of the components contained in the culture filtrate on the growth and reproduction of the halophile. Results： After heat treatment at 80 ℃， only when the culture filtrate was added， the halophile began to grow from about the tenth day， OD600≈0.2～0.3， and the presence of the halophile was confirmed by microscopic observation. Further， the effect of culture filtrate adsorbed by activated carbon and dissolved by ethanol was also studied. As a result， 100% ethanol solution was added to the heat-treated halophile for culture， which at 70 ℃ tend to have a delayed growth. It can be inferred that there may be some components in the culture filtrate that hinder the growth of the halophile. According to the present study， it was clearly confirmed that the culture filtrate contained both the growth promoting factor and the inhibitory factor of halophile. By analyzing these components， it is expected that the dormancy mechanism can be explained clearly and the research basis for the study of the heat resistance of other extreme halophiles is provided.

Key Words： Extreme halophiles; Halobacterium salinarum; Heat resistance factor; Culture filtrate

最早記載極端嗜鹽菌存在的是《本草綱目》中記載的“引清水注入，久則色赤。待夏秋南風(fēng)大起，則一夜結(jié)成，謂之鹽南風(fēng)”[1]。這句話指：鹽水被太陽(yáng)照射濃縮的階段逐漸變紅，經(jīng)過(guò)一夜的南風(fēng)食鹽的結(jié)晶析出來(lái)的意思。根據(jù)現(xiàn)在的知識(shí)，指含有菌紅素的極端嗜鹽菌繁殖，鹽水變成紅色的意思。1914年，Pierce首次確切地描述了鹵水中的紅色細(xì)菌[2]。

該研究使用的Halobacterium salinarum是極端嗜鹽菌的模型生物之一。一直以來(lái)認(rèn)為，極端嗜鹽菌在40 ℃左右最易生長(zhǎng)，在55 ℃以上的環(huán)境中不能生存。但是在2003年龜倉(cāng)正博指出，利用海水曬鹽法制鹽時(shí)，在高溫鹽溶液中也有極端嗜鹽菌的存在[3]。并且，根據(jù)日本教育大學(xué)中山匡研究室的研究表明，Halobacterium salinarum在至少70 ℃、10 min處理后雖然比沒(méi)有熱處理的菌的生長(zhǎng)開始時(shí)間晚，但是能夠繁殖。從這個(gè)結(jié)果可以看出，極端嗜鹽菌具有耐熱性。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Halobacterium salinarum培養(yǎng)濾液對(duì)不同溫度處理菌的生長(zhǎng)繁殖的影響，確定了培養(yǎng)濾液中含有能夠使該菌從休眠狀態(tài)復(fù)蘇的有效成分，為進(jìn)一步研究該菌的休眠機(jī)制及耐熱因子的研究奠定基礎(chǔ)。

1? 實(shí)驗(yàn)器材

離心機(jī)、振蕩培養(yǎng)搖床、分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、活性炭柱、自動(dòng)分液收集器、顯微鏡。

2? 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)試劑：乙醇、苯酚、濃硫酸。

復(fù)合培養(yǎng)基：分別制備Solution A（NaCl 200 g，KCl 2.0 g，Citrate Na 3.0 g，MgSO4·7H2O 20 g，MnCl2·4H2O（3.6 g/L），F(xiàn)eSO4·7H2O（0.5 g/L）1.0 mL，加入蒸餾水，定容為800 mL）與Solution B（Yeast extract，10 g，Casamino acid 7.5 g，加入蒸餾水，定容為200 mL），調(diào)整pH=7.0，121 ℃，15 min高壓滅菌后混合。

Salt solution：制備Solution A（KCl 4.0 g，NaHCO3 0.2 g，NaBr 0.5 g，加入蒸餾水，定容為200 mL）、B（NaCl 250 g，加入蒸餾水，定容為700 mL）、C（NH4Cl 2.0 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05 g，KH2PO4 0.5 g，加入蒸餾水，定容為100 mL），Solution A、C分別調(diào)整為pH=7.0，Solution A、B 121 ℃，15 min高壓滅菌。Solution C膜過(guò)濾除菌。無(wú)菌條件下將Solution A、B、C混合。

3? 實(shí)驗(yàn)步驟

在55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃熱處理嗜鹽菌Halobacterium salinarum 10 min，在液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)14天，吸光度OD600的測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況。結(jié)果見(jiàn)圖1。將該菌第4天（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期）的培養(yǎng)物進(jìn)行膜過(guò)濾，收集培養(yǎng)濾液約40 mL。

對(duì)該菌分組進(jìn)行70 ℃、80 ℃、90 ℃ 10 min熱處理，在加入上述培養(yǎng)濾液的復(fù)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14天，測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況。

將收集的培養(yǎng)濾液流過(guò)自制活性炭柱，再用20%乙醇溶出活性物質(zhì)，離心濃縮，將溶出液稀釋為?????? 1.5 mg/mL，膜過(guò)濾除菌。40%、60%的乙醇溶出液制作方法相同，取該菌1 mL，加入Salt solution調(diào)節(jié)至OD600=4.0。取10支滅菌ep管，其中5支不加熱為對(duì)照組，另外5支加入800 μL Salt solution，加熱，達(dá)到至 80 ℃，加入本菌200 μL，80 ℃、10 min，迅速冷卻。隨后分別接種1～15 mL復(fù)合培養(yǎng)基中（內(nèi)含10%不同濃度的乙醇溶出液），37 ℃振蕩培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

與上述操作相同，將熱處理溫度分別設(shè)定為70 ℃、80 ℃和90 ℃，添加100%乙醇溶出液。

4? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

具體情況見(jiàn)圖1、圖2。

5? 分析討論

對(duì)Halobacterium salinarum進(jìn)行80 ℃、10 min熱處理后，如果不添加培養(yǎng)濾液，該菌不生長(zhǎng);添加培養(yǎng)濾液時(shí)，從第10天左右開始，OD600≈0.2～0.3，并且通過(guò)顯微鏡的觀察，確認(rèn)了該菌的存在。從以上事實(shí)可以看出，在培養(yǎng)濾液中，存在著某種打破菌的休眠狀態(tài)的成分。將培養(yǎng)濾液用活性炭進(jìn)行吸附，再分別用20%、40%、60%、100%的乙醇進(jìn)行溶出后的效果也進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：將100%的乙醇溶出液分別加入到????? 80 ℃、90 ℃、100 ℃的熱處理菌進(jìn)行培養(yǎng)，80 ℃和???? 90 ℃的熱處理菌沒(méi)有生長(zhǎng);70 ℃的熱處理菌有生長(zhǎng)延遲的傾向。從此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷出：培養(yǎng)濾液中有可能存在某種阻礙本菌生長(zhǎng)的成分。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中考慮分離提取出有效成分，并進(jìn)一步分析鑒定其性質(zhì)。根據(jù)本研究，再次證實(shí)了Halobacterium salinarum至少在?????? 70 ℃、加熱10 min的條件下仍可生長(zhǎng);并明確證實(shí)了培養(yǎng)濾液中既含有Halobacterium salinarum的生長(zhǎng)促進(jìn)因子，又含有阻礙因子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了極端嗜鹽菌中耐鹽基因片段和質(zhì)粒[4]決定其具有嗜鹽性，那么，決定其嗜熱性的主要因素是什么還需要進(jìn)一步研究。

根據(jù)以往的研究，Halobacterium salinarum在經(jīng)過(guò)熱處理之后，細(xì)胞表層的構(gòu)成物質(zhì)表層蛋白（S-layer）發(fā)生了變化。在此基礎(chǔ)上，如果能夠證明極端嗜鹽菌的耐熱性和與嗜熱菌之間的關(guān)系，可以期待系統(tǒng)發(fā)生樹的重建。該菌既具有極端嗜鹽性又具有一定程度的耐熱性，考慮與其是多倍體有關(guān)，因此具有更高效的DNA雙鏈修復(fù)系統(tǒng)和極低的自發(fā)突變率，因此在極端環(huán)境下的適應(yīng)能力超出其他生物[5]。也正是由于極端嗜鹽菌生存環(huán)境的特殊性，其保存有一定的困難。今后考慮加入蔗糖、海藻糖優(yōu)化其冷凍干燥條件[6]，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和平行性。

參考文獻(xiàn)

[1]?李時(shí)珍.本草綱目[M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2018.

[2]?Aharon Oren， Rahel Elevi， Satoshi Watanabe， et al. Halomicrobium mukohataei gen. nov.， comb.nov.， and emended description of Halomicrobium mukohataei[J]. Int J Syst Evol Microbiol，2020，52（5）：1831-1835.

[3]?龜倉(cāng)正博，古賀洋介.古細(xì)菌的生物學(xué)[M].東京：東京大學(xué)出版社，1998.

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[6]?劉媛媛.小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定分析與耐熱相關(guān)基因的初步研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

[7]?毛建.環(huán)氧樹脂耐熱模型與硬質(zhì)鏈段增韌改性的研究[D].武漢理工大學(xué)，2016.