利用ssr標記淺析云南登革熱重點地區(qū)埃及伊蚊種群遺傳特征

鄭宇婷，姜進勇，周紅寧，馬雅軍

登革熱(Dengue Fever)是登革病毒(Dengue virus)經蚊媒傳播引起的急性蟲媒傳染病，主要在熱帶和亞熱帶流行[1]。1779年首次發(fā)現(xiàn)登革熱病例[2]，全球約25億人有感染登革病毒的危險，每年約有1億新感染病例，其中50萬重癥病例需住院治療[3]。我國最早在1873年廈門首次報道，1995年后呈局部暴發(fā)、輸入性流行的特征[2]，2004年以來廣東、福建、浙江等省份多次暴發(fā)本地疫情是我國重點防控區(qū)[4-6]。與云南省接壤的越南、緬甸和老撾等國家為登革熱常年流行區(qū)[7]。云南省最早發(fā)現(xiàn)登革熱病例是在1975年河口縣[8]， 2004年以來有散在輸入病例報告，2008年在德宏州芒市、臨滄市鎮(zhèn)康縣首次報道云南省登革熱本地病例[9-10]， 2013年景洪市暴發(fā)登革熱本地疫情[10]，此后我省西雙版納州景洪市、勐臘縣、德宏州瑞麗市、臨滄市耿馬縣等多次暴發(fā)流行，且流行日趨嚴重，登革熱已經成為我省邊境地區(qū)重要的蟲媒傳染病，嚴重危害邊境地區(qū)人群健康。

埃及伊蚊(Aedesaegypti)是登革熱的重要傳播媒介，其傳播能力遠高于白紋伊蚊。埃及伊蚊為云南省的入侵蚊蟲，2002年首次在瑞麗市發(fā)現(xiàn)，其后10余年間分布范圍不斷擴大，德宏州的芒市、隴川和盈江，西雙版納的景洪、勐臘、勐海，臨滄市的耿馬等3個州(市)、8個邊境縣(市)均有埃及伊蚊的分布[11-12]。埃及伊蚊的入侵加劇了云南省登革熱的暴發(fā)和流行風險。媒介控制是登革熱防控的重要措施，研究埃及伊蚊的遺傳特性，對登革熱防控具有重要意義。

微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeat，SSR)一般是由2～6個堿基為核心組成首尾相連的串聯(lián)重復序列。DNA的滑動復制導致微衛(wèi)星DNA長度多態(tài)性的產生，在埃及伊蚊種群特征的研究中，利用對核苷酸重復單位數(shù)目差異的研究來分析遺傳相關的各項指標。微衛(wèi)星因共顯性遺傳、高多態(tài)性和重復性好等特點，是研究蚊蟲群體遺傳結構理想的分子標記之一[13]，本研究采集云南省5個登革熱重點縣的埃及伊蚊，篩選12個多態(tài)微衛(wèi)星位點，通過微衛(wèi)星DNA標記分析云南省5個不同地理來源的埃及伊蚊種群的親緣關系群遺傳多樣性和遺傳結構特征，對有效防制埃及伊蚊、科學防控登革熱提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 依據(jù)埃及伊蚊入侵、定值和擴散的程度，選擇云南省德宏州瑞麗市、西雙版納州景洪市、勐臘縣、勐海縣、臨滄市耿馬縣作為調查地點，在埃及伊蚊蚊蟲密度高峰季節(jié)，采集花瓶、輪胎、水桶、廢棄瓶以及其他等容器中孳生的伊蚊幼蟲，帶回實驗室根據(jù)不同的孳生容器分開飼養(yǎng)至羽化，形態(tài)學鑒定蟲種[14]，并將鑒定出的埃及伊蚊保存于凍存管分裝，單管單只。每個點采集根據(jù)采集方位和孳生容器隨機抽取29～30只[15]埃及伊蚊成蚊樣本，確保采集樣本覆蓋每種孳生容器。低溫冰箱保存待后續(xù)實驗。

1.2實驗方法 樣本單管單只成蚊，采用DNA提取試劑盒[TIANamp Genomic DNA Kit(血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒)(離心柱型)(含蛋白酶K)]，按照試劑盒操作說明書提取蚊蟲組DNA，并用超微量核酸分析儀(杭州奧盛儀器有限公司，Nano-200)檢測濃度和純度，通過查閱文獻找出埃及伊蚊微衛(wèi)星位點的側翼序列[16]設計13對引物(表1)。

對每個樣本進行13對引物的PCR擴增，反應體系共25 μL：10*Ex Taq buffer 2.5 μL，DNTP (2.5 mmol/L) 2 μL，MIX primer 1 μL(MIX primer 為正、反向引物等量混合)，DNA模板1 μL，Ex Taq 0.2 μL，H2O 18.3 μL。反應條件為：96 ℃ 5 m, 96 ℃ 20 s, 53～58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,10個循環(huán)；96 ℃ 20 s, 52 ℃ 30 s,72 ℃30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 m。擴增產物毛細管電泳后得到原始數(shù)據(jù)(華大基因公司完成)。

表1 埃及伊蚊13個微衛(wèi)星位點引物的相關信息

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用GeneMaker(version2.20)對原始數(shù)據(jù)進行分析處理，利用GenAIEx 6.503計算各基因座等位基因數(shù)(number of allele, Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of allele, Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity， Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity， He)、群體內近交系數(shù)(population inbreeding coefficient, Fis)、遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient, Fst)、基因流(number of migrants per generation, Nm)以及Nei氏標準遺傳距離(Nei’s standard genetic distance)、遺傳相似系數(shù)(Nei’s standard genetic Identity)等指標，并根據(jù)遺傳分化和地理距離進行mantel test分析。使用PIC-CALC軟件計算多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。利用Arlequin3.5.1計算種群間成對固定指數(shù)Fst。

2 結 果

2.1蚊蟲采集結果 2017年6月1日-24日分別在瑞麗、勐臘、景洪、勐海、耿馬采集伊蚊幼蟲，并在顯微鏡下初步判定，收集埃及伊蚊幼蟲并飼養(yǎng)至成蚊，共收集234個有伊蚊幼蟲的容器，經鑒定飼養(yǎng)收集的埃及伊蚊有603只(表2)。

不同孳生容器中隨機選取1～10只，總149只開展實驗(表3)。

表2 埃及伊蚊采樣信息表

表3 選取埃及伊蚊實驗樣本信息表

2.2毛細管電泳擴增的結果 樣本DNA提取經超微量核酸提取儀檢測后濃度在16.51～77.88 ng/μL，經過毛細管電泳擴增以后共得到1 750個有效片段用于埃及伊蚊的遺傳特征分析，其中AG7、AC4、AC2引物擴增效果最理想，全部擴增出有效片段；AC1引物擴增效果最差。擴增產物大小為91～197 bp之間。用GeneMaker(version2.20)對原始數(shù)據(jù)進行分析處理，檢測數(shù)據(jù)和結果較多，分別選取2個位點的2個樣本的系列圖峰作為示例描述。圖1分別是樣本MH066位點AG1上的雜合子、樣本RLCQ23位點AC4上的純合子。

(MH066AG1為雜合子，大小為107和114；RLCQ23AC4為純合子，大小為115和115)

2.3微衛(wèi)星遺傳多樣性 CT2位點未擴增出目的片段，其余12對微衛(wèi)星標記對5個不同地理位置：景洪、勐臘、勐海、瑞麗、耿馬的埃及伊蚊自然種群進行擴增，共檢測到216個等位基因，每個位點的等位基因個數(shù)為10～31個，所有位點的平均等位基因數(shù)為18，有效等位基因為4.653個。其中，位點AG7和AG2的等位基因為31個，等位基因數(shù)量最多；位點AG3的等位基因為10個，數(shù)量最少。觀測雜合度為0.548～0.910之間，平均值為0.711；期望雜合度為0.623～0.827，平均值為0.728。12個多態(tài)位點的多態(tài)信息含量范圍為0.615～0.881，平均PIC 為0.778。其中AG1位點標記PIC指數(shù)最高為0.881，AC1位點的標記PIC指數(shù)最低為0.615(表4)。

從種群角度分析，平均每個種群的等位基因數(shù)在7.750～10.583之間，等位基因數(shù)最多的是耿馬，最少的是勐臘(表5)。5個自然種群平均觀測雜合度分布范圍是0.661(JH)～0.741(ML)，平均期望雜合度的分布范圍在0.629(ML)～0.774(RL)之間。PIC指數(shù)最高是RL種群(0.750),最低是ML種群(0.588)(表5)。

2.4遺傳分化系數(shù)及基因流 12個微衛(wèi)星位點的群體內近交系數(shù)(Fis)有8個位點的雜合子過剩(Fis>0),4個位點的雜合子缺失(Fis<0)，F(xiàn)is范圍在0.220～0.207之間，平均值為0.028，AC1和AG2位點的Fis和Fit值最高，分別為0.207、0.137和0.260、0.267。說明這2個位點群體內近交程度較其他位點高(表6)。

表4 12個微衛(wèi)星位點的總遺傳參數(shù)

表5 云南省5個埃及伊蚊自然種群12個微衛(wèi)星位點的遺傳特征數(shù)值

按照Balloux等[17]的遺傳分化的標準(低:0.15～0.25，中：0.05～0.15，高：0～0.05)，本研究群體間近交系數(shù)(Fst)平均值為0.078，為中度遺傳分化。

云南5個埃及伊蚊群體Nm均值為3.321，AG5位點上的基因流最大(5.210)，AG2位點上的基因流最小(1.414)。所有位點的基因流均大于1(表6)。

表6 云南5個埃及伊蚊種群12個微衛(wèi)星位點上的遺傳分化系數(shù)和基因流的情況

應用GenALEx軟件中的Mantel Test檢驗埃及伊蚊種群間遺傳分化和地理距離的相關性，地理距離(表7)由采樣點經緯度計算得出，未發(fā)現(xiàn)相關性(y=4E-07x+0.251 1，R2=0.263 5，P=0.100)。

表7 云南5個埃及伊蚊自然種群間地理距離(對角線之上)與遺傳分化(對角線之下)矩陣表

2.5云南5個自然種群間遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離 Nei’s標準遺傳距離在0.162～0.527之間，對應的遺傳相似度在0.590～0.850之間(表8)。

表8 5個埃及伊蚊種群Nei’s標準遺傳距離(對角線之下)與遺傳相似系數(shù)(對角線之上)

勐臘與勐海群體的遺傳相似度最高為0.850，遺傳距離為0.162；勐臘與瑞麗群體的遺傳相似度最低為0.590，遺傳距離為0.527。

3 討 論

5個埃及伊蚊自然種群的遺傳多樣性、生物多樣性研究中遺傳多樣性的研究尤為重要，等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息量等參數(shù)用于反映遺傳多樣性水平的重要指標，其值越大，說明基因豐富度越高、生物對環(huán)境的適應能力越強[18]。

本研究利用12對微衛(wèi)星分子標記對5個埃及伊蚊自然種群進行遺傳多樣性分析，12個位點平均Ho為0.711，平均He為0.728，平均PIC為0.778，平均每個種群的等位基因數(shù)在7.75～10.583之間，表明各種群遺傳多樣性較高，與石清明、劉蓬勃等的研究結果項目一致[19-20]。景洪、瑞麗、勐海、耿馬、勐臘的平均Ho分別為0.661、0.699、0.722、0.729、0.741；平均He分別為0.725、0.774、0.751、0.758、0.629；平均PIC分別為0.691、0.750、0.724、0.731、0.588，雜合度代表基因多樣度，在不考慮樣本數(shù)量影響的情況下，反應群體在多個基因位點的遺傳變異程度。本研究中景洪、瑞麗、耿馬、勐海種群平均期望雜合度高于平均觀測雜合度，意味著種群內可能存在近交；勐臘種群平均觀測雜合度高于平均期望雜合度，意味著種群可能有大量外來個體的補充，或者可能經歷了瓶頸效應或奠基者效應[19]。參照Botstein等提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標，本研究5個種群PIC都大于0.5(平均為0.697)，為高度多態(tài)。5個群體中瑞麗的PIC最高，表明呈現(xiàn)高度多態(tài)。

5個埃及伊蚊自然種群的遺傳和親緣關系群體內近交系數(shù)，其值越接近0，基因的分布越接近平衡，值為負時提示雜合子缺失，值為正時存在雜合子過剩[21]。基因在群體中的流動稱為基因流，Nm越大說明群體越均勻[22]，大于1則能夠抑制群體間的分化[23]。

各種群的近交系數(shù)中勐臘Fis值為負，表示與其他種群近交程度很低，其他4個種群為正，說明這些種群中存在著不同程度的近交。5個自然種群的樣本成對固定指數(shù)Fst均在0.057～0.148之間，表示種群間中度分化?；蛄鱊m越大，群體間的相似性越大。5個自然種群12個微衛(wèi)星位點的平均Nm為3.321，種群基因流較高，暗示5個群體間遺傳交流水平高，能夠抵制遺傳漂變作用和防止種群分化的發(fā)生。與劉蓬勃[20]、石清明等[19]的研究結果一致。

遺傳距離和相似度都是用來分析群體之間的親緣關系，5個群體之間勐臘和瑞麗的Nei’s遺傳距離最大，遺傳相似度最低，表明這2個群體的親緣關系最遠；勐臘和勐海的Nei’s遺傳距離最小，遺傳相似度最高，說明這2個群體的親緣關系最近。經計算5個自然種群的地理距離和遺傳分化之間無顯著相關性。

本研究采用微衛(wèi)星標記技術對云南省5個埃及伊蚊自然種群進行遺傳多樣性分析，多樣性指標PIC為0.588～0.750，呈現(xiàn)高度多態(tài)性，近交系數(shù)為0.028；遺傳分化系數(shù)為0.078，基因流均值為3.321，表明群體間遺傳交流水平高，存在一定程度的遺傳分化。5個群體間的遺傳距離為0.162～0.527之間，勐臘和勐海群體遺傳距離最小，親緣關系最近，勐臘和瑞麗的群體遺傳距離最遠，親緣關系最遠。景洪、瑞麗、勐海、耿馬的埃及伊蚊種群存在著不同程度的近交，勐臘的埃及伊蚊種群可能經歷過瓶頸效應或者有大量外來個體補充，還需要進一步確定。

利益沖突：無