皰疹病毒治療性疫苗研究進(jìn)展

劉 占,馬寧寧,郭子儀,鄧夢夢,史志斌,陳 陸

皰疹病毒科病毒為雙股線性DNA病毒，是引起人與動(dòng)物疾病的一類重要病原。根據(jù)病毒的生物學(xué)特性和基因組特點(diǎn)，皰疹病毒科可分為α、β和γ 3個(gè)亞科。皰疹病毒典型的感染特征是能夠建立潛伏感染，感染者或康復(fù)者長期攜帶病毒，在潛伏感染期間，病毒保持休眠狀態(tài)，借以逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。而機(jī)體在受到應(yīng)激后，潛伏的病毒被重新激活，并引起相應(yīng)的疾病，這一特點(diǎn)使得皰疹病毒感染難以被根治。

治療性疫苗能改善及增強(qiáng)機(jī)體對疫苗靶抗原的攝入、表達(dá)、處理、遞呈，激活免疫應(yīng)答，喚起機(jī)體對靶抗原的免疫應(yīng)答能力，達(dá)到清除病原體或異常細(xì)胞從而治愈疾病的作用。治療性疫苗已在艾滋病[1]、慢性乙型肝炎[2]、腫瘤[3]等多種疾病領(lǐng)域取得較大的進(jìn)展。目前皰疹病毒感染引發(fā)的各類疾病仍以預(yù)防性疫苗接種和抗病毒藥物治療為主，無法防止其復(fù)發(fā)性感染。因此，研發(fā)可抑制皰疹病毒復(fù)發(fā)性感染或清除潛伏感染的治療性疫苗具有重要意義。

1 皰疹病毒潛伏感染與再激活

皰疹病毒最初感染宿主時(shí)，病毒粒子通過破損的皮膚、黏膜等侵入機(jī)體，隨即在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖，在復(fù)制期間，皰疹病毒基因組以級聯(lián)方式進(jìn)行相關(guān)蛋白的表達(dá)。之后嗜神經(jīng)性子代皰疹病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)，跨突觸在神經(jīng)元間傳播，最后沿著神經(jīng)軸索逆行運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)元胞體并建立潛伏感染。潛伏感染期間，皰疹病毒以嚴(yán)格的機(jī)制維持潛伏感染狀態(tài)，病毒DNA在細(xì)胞內(nèi)以附加體的形式存在，裂解性基因處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，病毒基因組僅限于潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(Latency-associated transcripts，LAT)的轉(zhuǎn)錄，被感染的細(xì)胞不產(chǎn)生感染性病毒粒子，因而宿主不表現(xiàn)出任何臨床癥狀[4]。具有神經(jīng)嗜性的皰疹病毒通過潛伏在宿主不進(jìn)行分裂的感覺神經(jīng)元細(xì)胞中，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，僅有極少部分基因仍保持較低水平的表達(dá)，以保證病毒能被有效激活。具有淋巴嗜性的皰疹病毒在潛伏感染期間則保證基因組特定基因在其貯存的淋巴細(xì)胞特定區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，通過此嚴(yán)格調(diào)控機(jī)制介導(dǎo)病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，且能夠保證被感染細(xì)胞不會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。潛伏感染期間，當(dāng)機(jī)體免疫水平降低、宿主處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，休眠狀態(tài)的病毒被重新激活，病毒裂解性基因大量表達(dá)，從而增殖感染性病毒粒子并引發(fā)相關(guān)疾病。皰疹病毒潛伏感染再激活由一系列機(jī)制維持，包括特異的神經(jīng)因子、病毒因子(如LAT和病毒微小RNA)及對病毒基因組的表觀遺傳學(xué)調(diào)控[6]。因此，很有必要構(gòu)建一些不表達(dá)特定因子的突變體病毒，并研究其對潛伏感染再激活的影響。

2 皰疹病毒治療性疫苗的目標(biāo)

多數(shù)皰疹病毒可以在機(jī)體內(nèi)建立長期潛伏感染，目前尚無機(jī)體免疫可以清除潛伏感染的證據(jù)?？共《舅幬锆煼m然在控制復(fù)發(fā)性皰疹病毒感染上有一定成效，但該法用藥周期長且病毒可能發(fā)生變異而產(chǎn)生耐藥性[7]，并不能有效防止病毒復(fù)發(fā)性感染。皰疹病毒預(yù)防性疫苗并不能預(yù)防潛伏性感染的建立，且未能有效阻止機(jī)體發(fā)生復(fù)發(fā)性感染[8-10]。治療性疫苗的最終目的是能夠激活有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能產(chǎn)生長期的記憶性細(xì)胞反應(yīng)，可以防止病毒復(fù)發(fā)性感染，因此，治療性疫苗更具有優(yōu)勢和應(yīng)用前景[11]。治療性疫苗是通過誘導(dǎo)或增強(qiáng)特定的免疫功能，增強(qiáng)控制潛伏感染的特異性免疫反應(yīng)的能力，從而減輕復(fù)發(fā)性疾病的癥狀和體征以及降低復(fù)發(fā)率。皰疹病毒復(fù)發(fā)性感染時(shí)不斷刺激相對應(yīng)的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，最終造成這些細(xì)胞的耗竭，逐步喪失效應(yīng)功能、增殖潛力以及分化為免疫記憶細(xì)胞的能力。因此研發(fā)的治療性疫苗可以刺激這些病毒特異性CD8+T細(xì)胞，使之重新增殖形成更多的具有效應(yīng)功能的特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞群(Cytotoxic T cell，CTL)，進(jìn)而殺滅病毒感染的細(xì)胞。潛伏感染的建立常伴隨著抑制性免疫微環(huán)境的形成，因此，皰疹病毒治療性疫苗的研發(fā)須著重于調(diào)控或逆轉(zhuǎn)病毒感染造成的抑制性免疫微環(huán)境以及提高疫苗誘導(dǎo)形成的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞在抑制性免疫微環(huán)境下的免疫應(yīng)答效力。隨著對抗病毒免疫應(yīng)答認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞不僅有助于CTL的活化，而且其本身也發(fā)揮著多種效應(yīng)細(xì)胞的功能。因此，理想的治療性疫苗應(yīng)該考慮多種抗原的多價(jià)多表位與疫苗組合，在提高疫苗免疫原性方面最大限度發(fā)揮CTL抗病毒作用，同時(shí)充分發(fā)揮其它抗病毒成分的功能。

3 基于T細(xì)胞的皰疹病毒治療性疫苗研究進(jìn)展

多數(shù)皰疹病毒發(fā)展出多種機(jī)制來逃避宿主的免疫應(yīng)答，并在機(jī)體內(nèi)建立潛伏感染。適應(yīng)性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的T細(xì)胞可以清除病毒感染的細(xì)胞且具有特異性及長期免疫記憶能力，鑒于T細(xì)胞免疫應(yīng)答對控制皰疹病毒再激活的重要性，目前研發(fā)的皰疹病毒治療性疫苗多數(shù)基于誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的原理而設(shè)計(jì)。

3.1基于系統(tǒng)性效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗 T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫在抗皰疹病毒感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，皰疹病毒感染機(jī)體后誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的全身性免疫應(yīng)答，T細(xì)胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞，協(xié)同細(xì)胞因子對抗原進(jìn)行直接殺傷，因此治療性疫苗的效果與機(jī)體誘導(dǎo)系統(tǒng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的強(qiáng)弱和持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。基于此，Bernstein等[12]考慮到治療性單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus, HSV)亞單位疫苗的抗原和佐劑選擇在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面的重要性，研發(fā)了一種HSV-2治療性疫苗—GEN-003。該疫苗將HSV感染者抗體和CD4+T細(xì)胞識(shí)別的主要靶抗原gD2與運(yùn)用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定的CD8+T細(xì)胞抗原感染細(xì)胞蛋白4(infected cell protein 4, ICP4)相結(jié)合，并應(yīng)用了增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑Matrix-M2。由于IFN-γ是反映疫苗誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子[13]，研究通過IFN-γELISPOT方法檢測疫苗免疫小鼠后T細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)弱程度，結(jié)果證明該疫苗誘導(dǎo)更加強(qiáng)烈持久的系統(tǒng)性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，接種后可減少約50%的疾病復(fù)發(fā)率。

愛潑斯坦-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus, EBV)與鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大多數(shù)治療性EBV疫苗的研究都與NPC相關(guān)[14]，且EBV的 核抗原1 (Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1,EBNA1)和潛伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2,LMP2)抗原是免疫治療的靶點(diǎn)?；赥細(xì)胞免疫應(yīng)答在控制皰疹病毒感染過程中的重要性，朱偉等[15]使用含有EBV LMP2與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合基因CSF2A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，載有抗原肽的樹突狀細(xì)胞遷移至二級淋巴器官，在此激活特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)活化機(jī)體更多的EBV LMP2特異性CTL，具有更強(qiáng)的殺傷EBV腫瘤細(xì)胞作用。Taylor等[16]研發(fā)了以安卡拉牛痘病毒為載體同時(shí)表達(dá)部分EBNA1和全長LMP2兩種蛋白的疫苗，并通過IFN-γELISPOT方法檢測抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量變化。結(jié)果證實(shí)與免疫前相比外周血中特異性CTL 數(shù)量提高了數(shù)倍，誘導(dǎo)了更高水平的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。另外，靶向 EBNA1和LMP2抗原的治療性疫苗在專注于誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持續(xù)的CTL反應(yīng)的同時(shí)也應(yīng)注重疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性CTL的活性。Ge等[17]利用激光掃描共聚焦顯微鏡和實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測CTLs介導(dǎo)的靶細(xì)胞特異性殺傷能力及殺傷效率，發(fā)現(xiàn)重組腺病毒rAd-LMP2疫苗誘導(dǎo)的LMP2特異性CTLs對表達(dá)EBV-LMP2的腫瘤細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒性，展現(xiàn)較好的腫瘤細(xì)胞殺傷效率。該研究將有助于了解以EBV-LMP2為靶點(diǎn)的治療性疫苗并改進(jìn)其免疫治療策略以達(dá)到更好的臨床效果。

3.2基于局部性記憶T細(xì)胞反應(yīng)的治療性疫苗 皰疹病毒感染后，機(jī)體產(chǎn)生CTL和輔助性CD4+T細(xì)胞來控制病原體的擴(kuò)散，并產(chǎn)生記憶細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體發(fā)生復(fù)發(fā)性感染時(shí)，存在感染部位的組織常駐記憶T細(xì)胞(Tissue-resident memory T cells，TRM)發(fā)生增殖，同時(shí)中央記憶T細(xì)胞(central memory T cells，TCM)分化出大量外周組織循環(huán)效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Effector memory T cells，TEM)遷移到感染部位，從而迅速產(chǎn)生強(qiáng)烈的局部性免疫記憶反應(yīng)，抑制病毒的再激活[18]。因此，治療性疫苗設(shè)計(jì)的重要策略之一是增加機(jī)體TEM和TRM細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而誘導(dǎo)局部強(qiáng)烈持久的T細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)。Khan等[19]對HSV-1進(jìn)行了全基因組分析，篩選出3個(gè)激活多功能效應(yīng)記憶T細(xì)胞的HLA-A*0201限制性CD8+T細(xì)胞表位肽，并使用3個(gè)無癥狀潛伏感染個(gè)體的CD8+T細(xì)胞表位刺激CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生，然后再局部注射趨化因子CXCL10以在三叉神經(jīng)節(jié)部位招募足夠數(shù)量的HSV-1特異性T細(xì)胞，通過檢測重新激活HSV-1后小鼠眼部的病毒滴度及臨床癥狀的變化，證明了該策略增加潛伏感染HSV-1的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠TG部位特異性CD8+TEM和TRM數(shù)量并且增強(qiáng)它們的功能，從而有效抑制HSV-1的再激活，減少皰疹性眼病的復(fù)發(fā)。

機(jī)體清除入侵的皰疹病毒后，在淋巴和外周組織均建立了記憶性T淋巴細(xì)胞群，然而當(dāng)機(jī)體發(fā)生復(fù)發(fā)性感染時(shí)，TEM細(xì)胞向皮膚、陰道等外周組織的遷移受到粘附分子和趨化因子受體表達(dá)的高度限制[20]。當(dāng)HSV-2感染患者機(jī)體發(fā)生復(fù)發(fā)性感染時(shí)TRM細(xì)胞最先迅速作出反應(yīng)，通過分泌IFN-γ控制住病毒的擴(kuò)散并進(jìn)一步清除病毒，發(fā)揮重要的免疫保護(hù)作用[21]。因此，與TEM細(xì)胞相比，TRM細(xì)胞在機(jī)體發(fā)生復(fù)發(fā)性HSV-2感染期間可以更好的增強(qiáng)復(fù)發(fā)性感染局部免疫力。Bernstein等[22]設(shè)計(jì)了含有HSV-2糖蛋白gB、gC和gE并加入免疫佐劑CpG的三價(jià)亞單位疫苗，該疫苗選擇的3種抗原可以有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。利用豚鼠模型接種該疫苗誘導(dǎo)強(qiáng)烈的系統(tǒng)性T細(xì)胞反應(yīng)，然后通過局部使用咪喹莫特增加豚鼠背根神經(jīng)節(jié)和陰道黏膜內(nèi)CD8+TRM細(xì)胞數(shù)量，從而誘導(dǎo)復(fù)發(fā)性感染部位更加強(qiáng)烈的局部特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)了HSV-2治療性疫苗的治療效果，顯著降低了生殖器皰疹的復(fù)發(fā)率。Srivastava等[23]篩選出無癥狀潛伏感染者中被效應(yīng)CD4+和CD8+T細(xì)胞高度識(shí)別并具有良好免疫原性的8種HSV-2蛋白，其中由UL40基因編碼的核糖核苷酸還原酶2(RR2)是最具免疫原性的病毒蛋白，選取該蛋白在復(fù)發(fā)性生殖器皰疹豚鼠模型中探索其免疫原性和保護(hù)性效果，結(jié)果證實(shí)接種含有RR2蛋白的亞單位疫苗后機(jī)體產(chǎn)生較高的中和抗體效價(jià)，且RR2誘導(dǎo)的抗體與免疫治療糖蛋白(例如gB和gD)發(fā)生了交叉反應(yīng)，該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生陰道黏膜內(nèi)功能更強(qiáng)、數(shù)量更多的CD4+和CD8+TRM細(xì)胞，顯著減少了復(fù)發(fā)性生殖器皰疹病變和復(fù)發(fā)頻率。上述研究證明2種特異性記憶細(xì)胞在防止皰疹病毒感染性疾病的復(fù)發(fā)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如果可以通過某種治療性疫苗將足夠數(shù)量的特異性TEM和TRM細(xì)胞招募到機(jī)體復(fù)發(fā)性感染的部位中，則可能永久遏制病毒的再激活。

3.3基于過繼性T細(xì)胞療法的治療性疫苗 EBV感染機(jī)體后激活B淋巴細(xì)胞使其擴(kuò)增并在此細(xì)胞內(nèi)建立潛伏感染，T細(xì)胞免疫反應(yīng)在EBV免疫治療中具有重要作用，T細(xì)胞與EBV的EBNA1、LMP1和LMP2抗原具有較高的親和力，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而控制病毒感染[24]。因此，可以輸注自體特異性CTL從而提高T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力，達(dá)到更好的免疫治療效果。Smith等[25]利用表達(dá)EBNA1、LMP1和LMP2 3種抗原表位的新型腺病毒載體—AdE1-LMPpoly體外刺激擴(kuò)增EBV特異性CTL進(jìn)行過繼性T細(xì)胞免疫治療，此方法與使用基于淋巴母細(xì)胞系刺激擴(kuò)增EBV特異性T細(xì)胞相比[26]，AdE1-LMPpoly載體可快速擴(kuò)增功能更強(qiáng)的T細(xì)胞，然后通過研究擴(kuò)增T細(xì)胞表型與功能特征及治療后臨床癥狀，證明該免疫治療策略誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的耐受性、安全性和有效性。免疫功能障礙人群感染EBV后，由于CD8+T細(xì)胞功能缺陷，被感染的自身反應(yīng)性B細(xì)胞和漿細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中滯留，從而導(dǎo)致多發(fā)性硬化癥的發(fā)生。Pender等[27]證明了多發(fā)性硬化癥患者腦中EBV感染的B細(xì)胞仍然表達(dá)上述3種抗原，利用AdE1-LMPpoly載體體外刺激擴(kuò)增EBV特異性CTL，然后輸注患者體內(nèi)，通過檢測患者臨床癥狀、腦部損傷情況以及腦脊液IgG含量變化，證明過繼轉(zhuǎn)移的CD8+T細(xì)胞殺死了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中EBV感染的B細(xì)胞，從而防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步的自身免疫攻擊。EBV特異性T細(xì)胞過繼免疫治療是一種靶向性和無毒性的免疫治療策略，但該方法受到主要潛伏相關(guān)基因和蛋白表達(dá)譜、HLA限制性以及已知EBV表位的低免疫顯性的限制[28]，因此擴(kuò)大EBV特異性T細(xì)胞表位庫克服其局限性是發(fā)展和改進(jìn)特異性免疫治療策略的主要挑戰(zhàn)。此外，人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)、人類皰疹病毒6型 (Herpesvirus 6, HHV-6)控制病毒感染也主要依賴T細(xì)胞免疫，且根據(jù)2種病毒感染治療研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)其在研治療性疫苗是基于過繼性T細(xì)胞療法而設(shè)計(jì)，研究證明利用轉(zhuǎn)移抗原特異性T細(xì)胞來建立免疫功能，也可以有效治療HCMV、HHV-6感染，過繼性T細(xì)胞治療已成為異基因造血干細(xì)胞移植患者HCMV、HHV-6再激活的一種治療方法[29-30]。

4 結(jié)論與展望

多數(shù)皰疹病毒感染機(jī)體后難以被監(jiān)測和控制，宿主經(jīng)常會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)性感染，治療其復(fù)發(fā)性感染成為了防控皰疹病毒的關(guān)鍵。治療性疫苗能夠激活有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)，徹底清除病毒，并能產(chǎn)生長期的記憶性細(xì)胞反應(yīng)，防止皰疹病毒的復(fù)發(fā)性感染并替代藥物治療。研究皰疹病毒治療性疫苗的模式病毒主要為HSV-1、HSV-2、EBV且多數(shù)皰疹病毒治療性疫苗都停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，還存在較多問題尚待進(jìn)一步研究。各亞科皰疹病毒之間具有極其相似的潛伏感染機(jī)制，隨著對皰疹病毒結(jié)構(gòu)及功能的深入研究，人們越來越清晰地認(rèn)識(shí)到，皰疹病毒潛伏和激活并非病毒基因獨(dú)立促成的，而是病毒、細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間相互作用的結(jié)果。因此，根據(jù)現(xiàn)有皰疹病毒治療性疫苗設(shè)計(jì)原理，結(jié)合皰疹病毒潛伏感染機(jī)理及免疫機(jī)制的深入研究，可以為其余皰疹病毒治療性疫苗的研發(fā)提供方向。皰疹病毒治療性疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景，未來期望可以通過治療性疫苗接種與其他形式的免疫治療方法相結(jié)合將免疫治療方法納入皰疹病毒標(biāo)準(zhǔn)治療方案。

利益沖突：無