中山市白紋伊蚊現(xiàn)場種群擊倒抗性基因檢測分析

楊羅菊，劉德星，陳 健，魏曉雅，李婷婷，邱德義，劉環(huán)宇

白紋伊蚊(Aedesalbopictus)在我國廣泛分布，是一種極具侵襲性的蚊蟲，是登革熱、黃熱病及基孔肯雅熱等蟲媒病的重要傳播媒介[1-2]，已嚴重影響到我國公共衛(wèi)生安全。目前對于蚊媒傳染病最有效的預防和控制措施仍是降低蚊密度，包括減少孳生地和使用殺蟲劑等對蚊蟲進行消殺。自上世紀80年代起，由于有機氯和有機磷農藥受到禁用或限用，擬除蟲菊酯類殺蟲劑已開始成為我國主要使用的殺蟲劑之一[3-4]，由于長期大范圍使用，已造成我國多地的白紋伊蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生不同程度的抗藥性[5-10]。

蚊蟲產生抗性的機制主要有靶標抗性、代謝抗性和行為抗性3種，其中靶標抗性是近幾年來的研究熱點[11-12]。蚊蟲神經細胞膜上電壓門控鈉離子通道(Voltage-gated sodium channel，VGSC)是擬除蟲菊酯類和DDT類殺蟲劑的作用靶點，當其編碼基因突變，相應的氨基酸發(fā)生改變會降低蚊蟲對這一類殺蟲劑的敏感性而產生抗性，故稱為靶標抗性，又稱為擊倒抗性(Knockdown resistance,kdr)[13-14]。自2011年Kasai在新加坡采集的白紋伊蚊現(xiàn)場種群中首次發(fā)現(xiàn)與抗性相關的kdr基因突變F1534C以來[15]，隨后在中國廣東、海南和云南[5,16-18]等多地的白紋伊蚊中也被檢測出來，但是在對廣東地區(qū)的白紋伊蚊種群的抗性研究中多數(shù)集中在廣州和深圳等地區(qū)[5,18]，缺乏對中山市白紋伊蚊擊倒抗性基因突變和抗藥性現(xiàn)狀的研究。此外，很多生物測定結果表明對于同種殺蟲劑，雄蚊比雌蚊敏感[19]，已有研究表明部分抗性基因在雌雄蚊之間存在差異表達[20]，但造成雌雄蚊抗性差異的原因尚未完全闡明。本研究對廣東省中山市雌性白紋伊蚊現(xiàn)場種群的kdr基因進行檢測，了解當前中山市白紋伊蚊擊倒抗性基因的突變情況，并將雌雄蚊的分子檢測數(shù)據(jù)進行對比，了解當?shù)匕准y伊蚊種群對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性現(xiàn)狀，檢驗不同性別白紋伊蚊之間的kdr基因突變是否存在差異，為當?shù)乜茖W使用殺蟲劑和蟲媒病防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1供試蚊蟲 2019年8月至11月，在廣東省中山市多年持續(xù)使用擬除蟲菊酯類殺蟲劑滅蚊的5個生境采集白紋伊蚊幼蟲及蛹，實驗室飼養(yǎng)至成蚊，經形態(tài)學鑒定，挑選羽化后3～5 d的白紋伊蚊成蚊進行擊倒抗性基因檢測。5個采樣點及其所屬的生境分別為：大尖山森林公園(DJ種群)為半原始狀態(tài)公園，植被豐富，天然水容器較多，且殺蟲劑使用較少；中山海關技術中心(HG種群)為辦公區(qū)，廣東藥科大學(GY種群)為城鄉(xiāng)結合部，2個采樣點人流量較大，定期會進行蚊蟲消殺；三溪村(SX種群)為城中村，生活環(huán)境較差，峰景花園小區(qū)(FJ種群)為居民區(qū)，人群較為密集，積水容器多，擬除蟲菊酯類殺蟲劑使用頻率較高。實驗室飼養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光周期14L∶10D，相對濕度60%～80%。

1.1.2主要儀器 PCR儀(美國Thermo fisher公司)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、離心機、不同量程的移液槍等。

1.1.3主要試劑 血液和組織 DNA 提取試劑盒(型號：DP304-02)購自天根生化科技有限公司，dNTP 、r-TaqDNA 聚合酶等購于大連寶生物有限公司，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2方 法

1.2.1白紋伊蚊基因組DNA提取 經形態(tài)學鑒定白紋伊蚊雌雄蚊，采用羽化3～5 d成蟲，按照試劑盒說明書提取單只蚊蟲基因組DNA。

1.2.2Kdr基因擴增和測序 以白紋伊蚊基因組DNA為模板，白紋伊蚊VGSC基因片段擴增引物序列：正向aegSCF7 5′—GAGAACTCGCCGATGAACTT—3′，反向aegSCR8 5′—TAGCTTTC-AGCGGCTTCTTC—3′[15]。PCR擴增體系：dNTP 2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，上、下游引物(10 μL/L)各1 μL，rTaq酶0.5 μL，加ddH2O補至50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 2 min；94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將出現(xiàn)目的條帶且條帶清晰明亮的樣品送至上海立菲公司測序，測序引物同擴增引物。

1.2.3序列比對和統(tǒng)計學分析 將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，用Primer Premier 5.0和MEGA6.0 軟件對序列進行比對和峰圖分析，分析基因突變情況。使用SPSS 19.0軟件，應用χ2檢驗比較不同性別成蚊kdr基因突變的差異。檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1單蚊基因組DNA提取及擴增 將5個生境采集的雌蚊276只，雄蚊293只，共569只白紋伊蚊分別提取基因組DNA，擴增后成功獲得569 個VGSC基因片段，

2.2kdr基因的等位基因和基因型 將獲得的白紋伊蚊基因序列在NCBI上進行BLAST比對，與白紋伊蚊VGSC基因domainsⅢ編碼區(qū)(KC152046.1)部分序列一致性達99.00%，長度約為400 bp。

對獲得的276只雌性白紋伊蚊kdr基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)1 532位點未出現(xiàn)突變，1 534位點存在突變。1 532位點僅有一種等位基因類型，即野生型ATC/I(100%)；一種基因型，即野生型純合子I/I(100%)。1 534位點共有5種等位基因，即野生型TTC/F(22.46%)，突變型TTG/L(55.80%)、TCC/S(14.13%)、TCG/S(7.25%)和TGC/C(0.36%)；8種基因型分別為野生型純合子F/F(1.81%)，野生突變型雜合子F/L(23.55%)、F/S(17.39%)和F/C(0.36%)，突變型純合子L/L(38.05%)和S/S(6.52%)，突變型雜合子L/S(11.96%)和L/C(0.36%)，詳見表1。

表1 中山市白紋伊蚊雌蚊現(xiàn)場種群kdr基因1 534位點的等位基因和基因型

2.3不同生境kdr基因的等位基因和基因型及其頻率 在5個生境中發(fā)現(xiàn)1 532位點尚未突變，等位基因均為野生型ATC/I，基因型為I/I。1 534位點在各個生境中均出現(xiàn)不同程度的突變，突變類型也較多。5個白紋伊蚊現(xiàn)場種群雌蚊的1 534位點的突變情況見圖1。5個采樣點的等位基因均以突變型TTG/L為主，突變率從高到低依次為GY種群(61.41%)、SX種群(60.17%)、FJ種群(55.66%)、DJ種群(54.08%)、HG種群(47.41%)；其次為野生型TTC/F，DJ種群的野生型等位基因頻率最高39.80%；突變型TCC/S和TCG/S的頻率較低，其中在突變型TCC/S中，以FJ種群和SX種群突變率最高，分別為23.59%和16.95%，其次HG種群和GY種群，分別為15.52%、8.77%，DJ種群最低為5.10%；HG種群的等位基因突變型TCG/S突變率最高，為17.24%，其次SX種群、FJ種群和GY種群的突變率相近，分別為6.78%、5.66%、5.26%，DJ種群未發(fā)現(xiàn)此種類型突變；僅在DJ種群和FJ種群發(fā)現(xiàn)等位基因突變型TGC/C，分別為1.02%和0.86%。

圖1 中山市白紋伊蚊現(xiàn)場種群雌蚊kdr基因1 534位點等位基因的類型和頻率

在中山市5個生境的白紋伊蚊雌蚊中，基因型的突變情況見圖2。在DJ種群中，以野生型雜合子F/L(55.10%)為主，其次是突變型純合子L/L(24.49%)；在其余4個種群中，均以L/L為主，分別為45.61%、39.62%、44.07%和34.48%。野生型雜合子F/C和突變型雜合子L/C頻率較少，僅在DJ種群存在F/C(2.04%)，L/C只出現(xiàn)在采樣點HG種群(1.72%)。在5個生境中，野生型純合子只在DJ種群(8.17%)和HG種群(1.72%)存在，其余3個種群中均未發(fā)現(xiàn)無野生型純合子。

圖2 中山市白紋伊蚊現(xiàn)場種群雌蚊kdr基因1 534位點基因型的類型和頻率

2.4白紋伊蚊kdr基因突變的性別差異 本研究共測試了雌蚊276只，雄蚊293只。在雌蚊現(xiàn)場種群中，kdr基因1 534位點的野生型(野生純合子)和突變型(含突變型雜合子和突變型純合子)分別為6只和270只；在雄蚊中野生型和突變型分別為10只和283只。 采用χ2檢驗，對不同性別白紋伊蚊的1 534位點的kdr基因型進行比較，結果顯示，雌蚊和雄蚊的kdr基因型的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.798，P>0.05)。1 532位點不存在突變型，均為野生型純合子。

3 討 論

目前國內已有白紋伊蚊現(xiàn)場種群的kdr基因1 532位點和1 534位點突變的一些研究[5,9,16]，1 532位點共有2種等位基因，即野生型 ATC/I 和突變型 ACC/T，此種突變在上海市、江蘇省南京市、云南省景洪市和瑞麗市、江西省南昌市、山東省濟寧市[5,17,21-23]等地的白紋伊蚊種群中均有檢測到，但本研究未檢測到1 532位點突變，這與趙春春2019年在廣州種群的檢測結果一致[5]。在本次研究檢測的5個采樣點的白紋伊蚊中1 534位點突變普遍存在，共5種等位基因，包括1種野生型TTC/F和4種突變型TTG/L、TCC/S、TCG/S、TGC/C。其中以等位基因TTG/L頻率最高，突變頻率范圍為47.41%～61.41%；其次為TCC/S，突變頻率范圍為5.10%～32.76%；TCG/C等位基因突變頻率最低，僅在DJ種群(1.02%)和HG種群(0.86%)存在。在5個采樣點中，DJ種群和HG種群存在野生型純合子F/F，且DJ種群野生型純合子F/F含量較高(8.17%)，而HG種群此種基因型頻率較低(1.72%)，其余采樣點均已突變無該野生型存在，這可能與DJ種群的環(huán)境更接近原始狀態(tài)，用藥較少，其他采樣點用藥較為頻繁有關。以上信息均提示當?shù)匕准y伊蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑已經產生抗藥性。1 534位點較1 532位點突變頻率高，突變類型多樣，這與2016年Xu[24]在廣東深圳、廣州種群檢測到的結果相似。很多研究顯示，我國多個地區(qū)的白紋伊蚊kdr基因1 534位點已發(fā)生突變，但各地區(qū)白紋伊蚊1 534位點的各等位基因的突變頻率不盡相同，比如在云南省瑞麗市和景洪市[22-23]、海南省海口市[16]和廣東省深圳市[24]等地的白紋伊蚊中，均以突變型TCC/S為主，而在本研究檢測的中山種群和Xu等[24]檢測的廣州種群中卻以TTG/L為主，這可能是由于各地區(qū)使用殺蟲劑的種類、使用時間和強度不同，引起基因突變的多態(tài)性，再經選擇壓力和遺傳，導致各地區(qū)1 534位點等位基因突變的優(yōu)勢類型存在差異。此外，本研究分析kdr基因突變時，使用采集的幼蟲和蛹在實驗室孵化成成蟲并區(qū)分雌雄蚊，避免了因蚊蟲發(fā)育階段不同和雌雄不一致對測定結果產生影響，使結果更具可靠性。

許多生物測定表明，雌雄蚊的抗藥性水平存在差異，對同一種類殺蟲劑，雄蚊比雌蚊敏感[19]。本研究結果顯示，不同性別白紋伊蚊的kdr基因1 534位點突變率無統(tǒng)計學差異，提示kdr基因1 534位點突變引起的蚊蟲抗藥性可能不是導致白紋伊蚊雌雄蚊抗性差異的主要原因。蚊蟲產生抗藥性的機制是多方面的，雌雄蚊的生理差異和外界環(huán)境等都會影響抗藥性的產生，可能其他抗性機制在引起雌雄蚊抗性差異中貢獻較大，如胡夢雪等對淡色庫蚊的研究顯示，與蚊抗性相關的基因乙酰葡萄糖胺水解酶蛋白基因和溶血磷脂酶基因在雌雄蚊中的表達存在兩性差異[20]，李士根等報道，在淡色庫蚊中雌蚊乙酰膽堿酯酶活性大于雄蚊[21]，但也不能排除擊倒抗性機制在其中的作用。通過對白紋伊蚊抗藥性的深入研究，從分子層面了解抗性機制，將有助于了解當?shù)匚孟x的抗藥性發(fā)展趨勢，對制定更加完善的控蚊防疫措施具有重要意義。

利益沖突：無